作者：樊廷俊
作者单位：(266003)中国山东省青岛市，中国海洋大学海洋生命学院海洋生物系；(266071)中国山东省青岛市，中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室
【摘要】目的：揭示黄酮对人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cells,HCEC）的抗氧化保护作用及其机制。
方法：利用HCEC的体外培养体系，采用形态观察，吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段研究了黄酮和/或过氧化氢（H2O2）处理对HCEC细胞凋亡的影响，使用酶联免疫吸附试验分别对70μmol/L黄酮和/或600μmol/L H2O2处理不同时间后HCEC中凋亡诱导因子（AIF）与细胞色素c（CytC）的浓度变化进行了检测。
结果：在600μmol/L H2O2处理8h，细胞凋亡率约为60%的HCEC氧化损伤模型中，70μmol/L黄酮预处理30min可使HCEC的细胞凋亡率降至约8%，而仅用黄酮处理组HCEC的细胞凋亡率约为1%。HCEC的总CytC浓度于H2O2处理3h后达到峰值（约为对照组的7.97倍），总AIF浓度于处理6h后达到峰值（约为对照组的1.28倍），而黄酮预处理组和仅用黄酮处理组HCEC的总CytC和AIF浓度与阴性对照组没有显著差异。
结论：H2O2诱发HCEC凋亡是促使线粒体中CytC和AIF的外流引起的；70μmol/L黄酮对600μmol/L H2O2所致HCEC细胞凋亡具有很强的抗氧化保护作用。
【关键词】 人角膜内皮细 过氧化氢 黄 细胞凋亡 抗氧化保护作用
0引言
位于角膜后表面的单层角膜内皮细胞在维持角膜的半脱水状态、厚度及透明性方面具有重要作用，这层细胞的密度一旦低于维持其生理功能的临界值就会引发不可逆角膜病变而致盲。引起导致角膜内皮细胞损伤的因素很多，活性氧自由基便是一类能诱发其发生细胞凋亡的重要因素[1]。因此，寻找有效的抗氧化药物保护角膜内皮细胞不发生凋亡，对于因角膜内皮细胞凋亡所致角膜病的预防和治疗具有重要意义。
黄酮类化合物(flavonoids)是一类广泛分布于植物界的天然抗氧化剂，具有抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性[2]。最近的研究结果还发现，黄酮类化合物具有抑制由过氧化氢（H2O2）引起的细胞凋亡，从而使黄酮类化合物称为一种治疗由氧化损伤所致角膜病的高潜质候选药物[3,4]。现有研究表明，黄酮类化合物不仅能降低细胞内的活性氧水平[5]，而且也能通过抑制胱冬肽酶的激活来抑制H2O2引起的细胞凋亡[6,7]。在与线粒体和活性氧相关的众多细胞凋亡因子中，凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor, AIF）和细胞色素c（cytochrome c, CytC）具有关键性作用[8]。随着粒线体中活性氧水平的提高，诱导了线粒体通透性转变孔(mitochondrion permeability transition pore, MPTP)的开放，CytC和AIF等便被释放至细胞质中，CytC通过与促凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf1)和胱冬肽酶原9形成凋亡复合体（apoptosome）激活胱冬肽酶9，进而激活执行胱冬肽酶3,6,7，使细胞因整体结构破坏、功能紊乱而凋亡[8,9]；而释放的AIF进入细胞核，直接作用于染色质DNA，与核酸内切酶G（Endo G）共同引起大规模DNA断片化，使细胞因染色质破坏而凋亡[10]。
到目前为止，有关黄酮类化合物对活性氧所致细胞凋亡抗氧化保护活性的具体作用机制仍不清楚，也未见到有关黄酮类化合物对H2O2所致HCEC凋亡的抗氧化保护过程中AIF与CytC变化的研究报道。我们利用体外培养人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cells, HCEC）研究了黄酮和/或H2O2对HCEC形态和细胞凋亡的影响作用，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法对黄酮和/或H2O2处理HCEC的总AIF及CytC浓度变化进行了研究，以揭示HCEC氧化损伤及黄酮抗氧化保护作用的机制，为抑制或延缓HCEC凋亡及其临床应用创造条件。
1材料和方法
1.1材料 HCEC来自本室自建的人角膜内皮细胞系（HCECfan）。胎牛血清为Hyclone公司产品，DMEM/F12(1∶1)培养液干粉和胰蛋白酶为Gibco公司产品，DL2000标准分子量DNA为Takara公司产品，兔抗AIF mAb为北京博奥森生物公司产品，兔抗CytC mAb为北京博奥森生物公司产品，HRP山羊抗兔IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，黄酮、蛋白酶K和RNA酶A为Sigma公司产品。黄酮用DMSO配成母液，过滤除菌后用DMEM/F 12(1∶1)培养液稀释成工作液，DMSO终浓度不超过1.0g/L。HCEC用含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液在50mL/L CO2，37℃培养条件下进行常规培养。待细胞长满培养瓶底面后，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞，以1/2的比率接种于新培养瓶内，加入完全培养液5mL进行传代培养。
1.2方法 细胞接种培养24h后，分别加入终浓度为400，600，800μmol/L的H2O2和终浓度为70μmol/L的黄酮于同样条件下继续培养。每组均取3个平行孔，以不加H2O2，其它条件相同的HCEC作为阴性对照。每隔2h于倒置显微镜下观察照相。
1.2.1 黄酮预处理对H2O2引起HCEC凋亡的影响 细胞按上述方法接种培养24h后，用浓度为70μmol/L的黄酮预处理30min，再加入600μmol/L H2O2于同样条件下继续培养。每组均取3个平行孔，以不加黄酮和H2O2，其它条件相同的HCEC作为阴性对照，以不经黄酮预处理直接加入600μmol/L H2O2，其它条件相同的HCEC作为阳性对照。每隔2h于倒置显微镜下观察照相。
1.2.2 HCEC凋亡的吖啶橙/溴化乙锭双染色鉴定 吖啶橙/溴化乙锭双染色参照斯佩克特等[11]的方法进行。分别收集不同方式处理8h后的HCEC，将细胞密度调整至2×109/L。取细胞悬液0.1mL，加入吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）溶液（100mg/L AO溶液:100mg/L EB溶液=1∶1）4μL，于室温下染色1min后滴在无荧光载玻片上，加盖片后置荧光显微镜观察并拍照。每个样品至少计数300个细胞，根据细胞核呈桔红色荧光为凋亡细胞，细胞核呈亮绿色荧光为正常细胞，计算细胞凋亡率：凋亡细胞数/（正常细胞数+凋亡细胞数）×100%。
1.2.3 HCEC DNA的琼脂糖凝胶电泳 分别收集不同方式处理8h后的HCEC，按照李凌等[12]的方法抽提DNA，分别溶于20μL TE缓冲液中。取DNA样品5μL用15g/L的琼脂糖凝胶（含0.5mg/L EB）进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置紫外检测仪中观察和照相记录。
1.2.4 HCEC凋亡的酶联免疫吸附试验检测 每隔1h分别收集不同方式处理的HCEC，经胰酶消化后离心收集细胞，将细胞密度调整至2×109/L，加入细胞裂解液300μL充分混匀，于冰浴中超声破碎5min，12000r/min于4℃离心30min，收集上清液，在96孔酶标板每孔中分别加入不同处理组待测样品100μL，每个阴性对照孔中加入未处理组细胞裂解液100μL，每组均取3个平行孔。4℃过夜包被后，用含0.5mL/L Tween20的PBS洗涤液洗3～4次，每孔分别加入含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭液100μL，37℃封闭60min。同上洗涤3～4次后，每孔分别加入1∶500稀释的兔抗人AIF或兔抗人CytC单克隆抗体使用液100μL，37℃孵育60min。同上洗涤后，每孔分别加入1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体使用液100μL，37℃孵育60min。同上洗涤后，每孔加入TMB使用液100μL，混匀后37℃暗处反应20～25min，每孔加2mol/L H2SO4 100μL终止反应，分别测定A450和A630。为减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰，以A450A630计为总AIF或CytC的浓度变化。
2结果
2.1 H2O2对HCEC的影响 终浓度为400～800μmol/L的H2O2持续作用8 h均可引起HCEC发生皱缩和脱落，且程度随H2O2浓度的增大而逐渐加剧（图 1）。AO/EB双染色结果显示，400～800μmol/L H2O2处理8h的HCEC均不同程度地发生了细胞凋亡，且随着浓度的提高细胞凋亡的程度逐渐加大，而无H2O2处理的对照组HCEC则没有发生细胞凋亡（图2）。HCEC的计数结果显示，400，600和800μmol/L H2O2处理8h可分别引起40%，60%和65%的HCEC发生细胞凋亡（表1）。DNA电泳结果显示，600和800μmol/L H2O2处理组HCEC的DNA在电泳图谱上出现了梯状条带（DNA ladder），即出现了DNA断片化，而400μmol/L H2O2处理组HCEC的DNA没有出现梯状条带，证明600和800μmol/L H2O2处理组HCEC确实发生了细胞凋亡（图3）。为了确定不同浓度黄酮的抗氧化活性即对H2O2诱导HCEC凋亡的保护作用，我们根据上述研究结果建立了体外培养HCEC的H2O2氧化损伤模型：600μmol/L H2O2处理8h，细胞凋亡率约为60%的体外培养HCEC。
图1H2O2处理8h后HCEC的变化（光学显微镜×100) （略）
A：未经H2O2处理；B：400μmol/L H2O2；C：600μmol/L H2O2；D：800μmol/L H2O2
图2H2O2处理8h后HCEC的凋亡核呈桔红色荧光者为凋亡细胞，核呈亮绿色荧光者为未凋亡细胞（AO/EB双染色×400) （略）
A：未经H2O2处理；B：400μmol/L H2O2；C：600μmol/L H2O2；D：800μmol/L H2O2
2.2黄酮预处理对 H2O2引起HCEC凋亡的保护作用 仅用黄酮处理组HCEC绝大部分处于伸展状态，形态与无黄酮或H2O2处理的对照组HCEC一致，仅极少数细胞发生细胞凋亡；而黄酮预处理H2O2再处理组HCEC大部分处于伸展状态，形态基本正常，仅少数细胞发生细胞凋亡（图4）。HCEC的计数结果显示，70μmol/L黄酮的预处理能将600μmol/L H2O2所引起的HCEC凋亡率从60%降低至8%（表2）。DNA电泳结果表明，两处理组HCEC的DNA在电泳图谱中均未出现梯状条带，即HCEC均未发生细胞凋亡（图5）。
图3H2O2处理HCEC的DNA电泳图谱（略）
M，DL2000 marker；A：未经H2O2处理；B：400μmol/L H2O2；C：600μmol/L H2O2；D：800μmol/L H2O2
表1 H2O2处理HCEC的细胞凋亡率（略）
表2黄酮和/或H2O2处理组HCEC的细胞凋亡率（略）
2.3黄酮和/或H2O2处理对HCEC中CytC浓度的影响 将600μmol/L H2O2处理组HCEC中CytC的浓度，于处理后迅速增大，在3h达到峰值，约为对照组CytC浓度的7.97倍，随后便逐渐减小，7h后出现下降幅度增大；而70μmol/L黄酮处理组HCEC和70μmol/L黄酮预处理30min后600μmol/L H2O2再处理的HCEC，其CytC的浓度在处理后8h内基本保持恒定，与对照组相比无显著差异（表3）。
2.4 黄酮和/或H2O2处理对HCEC中凋亡诱导因子浓度的影响 600μmol/L H2O2处理组HCEC中凋亡诱导因子（AIF）的浓度，于处理2h后开始升高，于6h后达到高峰，约为对照组AIF浓度的1.28倍，随后便开始缓慢下降；而70μmol/L 黄酮处理组HCEC中AIF的浓度，在处理后8h内基本保持恒定，与对照组相比无显著差异；70μmol/L黄酮预处理30min、再用600μmol/L H2O2处理的HCEC，其AIF的浓度在6h后开始逐渐增大，但增加幅度很小，仅比对照组增加了1.48%（表4）。
[1] [2] 下一页 |
