作者：张桂兰
作者单位：（443003）中国湖北省宜昌市中心人民医院眼科
【摘要】目的：探讨体外原代培养的兔晶状体上皮细胞（lens epithelial cells ,LEC）分泌活性转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGFβ1）和异常表达α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,αSMA）的状况变化
方法：体外原代培养兔眼LEC，当细胞接近融合时转板培养，观察细胞转板培养后1，6，12d的状态变化，并采用ELISA法检测各时项培养液上清中TGFβ1的水平，免疫细胞化学和计算机图像分析统计各时项细胞中αSMA的表达水平。
结果：转板培养12d的细胞活性TGFβ1的水平明显高于转板培养1和6d的水平（均P<0.05），同时转板培养12d的细胞表达αSMA的水平分别明显高于转板培养1和6d的水平（P<0.05）；而且αSMA的表达量随着TGFβ1水平的升高而升高，两者高度正相关（r=0.995，P<0.01）。
结论：原代培养的LEC活性TGFβ1逐渐增多，向表达有αSMA的肌成纤维细胞转分化。
【关键词】 晶状体上皮细胞 转化生长因子β1 α平滑肌肌动蛋白 上皮间质转分化
0 引言
目前，普遍认为白内障手术后导致残留的晶状体上皮细胞的环境和状态的改变，促进了后发性白内障的形成。我们观察原代培养的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LEC）的状态变化，寻找一种类似白内障手术后的LEC模型，从而为后发性白内障的分子生物学的防治研究提供基础。
1材料和方法
1.1材料 选2月龄大小的家兔30只，雌雄不限，质量不限（三峡大学实验动物中心）、优级胎牛血清FCS（杭州四季青生物工程材料有限公司）、DMEM干粉培养基和胰蛋白酶粉（美国Gibco公司）、ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司) 、鼠抗αSMA单克隆抗体（福州迈新生物技术有限公司）、恒温CO2细胞培养箱（Shldon Iab, USA）XSZDZ型倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）、7720062型正压滤器（美国Cole—Parmer Instrument Company）、Sigma318K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）、多功能酶标仪（TECAN GENios, Austria）、DMR型多功能显微镜测量系统（Leica, German）、微量加样器（法国Gilson公司）
1.2方法 耳缘静脉空气栓塞法处死家兔，取出眼球，置于1000KU/L的庆大霉素生理盐水中浸泡30min，将眼球取出到超净工作台中, DHanks液清洗3遍，在培养皿中解剖分离出晶状体赤道部上皮组织，剪碎成约2mm×2mm的小块，均匀铺于培养瓶底。将铺好组织块的培养瓶翻转倒置于37℃，50mL/L的CO2培养箱中4h。放正培养瓶，加入200mL/L FCS的DMEM培养液，于37℃，50mL/L CO2的培养箱中培养，每隔2～3d换1次培养液。细胞贴壁生长达瓶底80%时，用胰蛋白酶消化后离心，用含200mL/L FCS的DMEM培养液调整细胞密度1×108个/L。
图1 培养的LEC（×200）（略）
A:原代培养3d；B:转板培养1d；C:转板培养6d；D:转板培养12d
分别取2mL转入置好玻片的六孔培养板的各孔中，继续培养。从细胞的数量、大小和形态各方面观察不同时相（转板培养后1、6和12d）的晶状体上皮细胞的形态变化。
1.2.1 LEC培养液中活性TGFβ1浓度的检测 于不同培养时间计数各孔细胞数后吸取各孔上层培养液，分装于EP管，做好标记，将EP管放置低温高速离心机中，4℃，2 000rpm，离心20min，每管中各取上清液500μL，分装，标记，样本稀释，激活，严格按照ELISA试剂盒说明书进行ELISA检测，在酶标仪上450nm处测吸光值(A值)。分别以标准品的A值和浓度值为x，y轴，绘制标准曲线（y=1344.4x139.95,R2=0.9874）。根据样品A值在标准曲线上得出各样本相应的TGFβ1浓度值（ng/L），根据各样品TGFβ1浓度值×2mL/各孔细胞数，得出各孔样品平均每个细胞所对应的TGFβ1的量（ag/细胞）
1.2.2免疫细胞化学SP染色检测αSMA表达 取出不同培养时间的细胞爬片，DHanks液冲洗3次，每次5min；保持标本湿润，用1∶1的无水乙醇和冷丙酮固定15min，自然干燥；DHanks液冲洗3次，每次5min；擦干DHanks液，加过氧化酶阻断溶液（SP试剂盒内为试剂A）1滴/片，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性；1g/L TritonX100内浸20min；DHanks液冲洗3次，每次5min；擦干DHanks液，加正常非免疫动物血清（SP试剂盒内为试剂B）1滴/片，室温孵育10min；用吸水纸吸掉血清，加一抗（αSMA单抗）1滴/片，湿盒内4℃孵育过夜；DHanks液冲洗3次，每次5min；擦干DHanks液，加生物素标记的第二抗体（SP试剂盒内为试剂C）1滴/片，室温孵育60min；DHanks液冲洗3次，每次5min；擦干DHanks液，加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液（SP试剂盒内为试剂D）1滴/片，室温孵育60min；DHanks液冲洗3次，每次5min；擦干DHanks液，加新鲜配制的DAB溶液1滴/片，显微镜下观察为棕色（3～10min），适时终止显色；自来水冲洗，苏木素复染1min，自来水冲洗返蓝；盐酸酒精分化10s，自来水再次冲洗，蒸馏水冲洗、浸泡；吸水纸擦干，电吹风吹干，中性树胶封片，标记；将做好的免疫细胞化学玻片在DMR型多功能显微镜及测量系统上随机采取图片20张（显微镜下放大200倍）。
统计学处理：采用软件ImagePro Plus 5.0分析阳性着色强度的平均吸光度（A），求出平均值；应用SPSS 10.0软件，数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析多重比较的q检验法，当P<0.05时，差异有统计学意义。
2结果
2.1不同时相细胞的形态变化 倒置显微镜下观察，原代培养第3d，细胞开始从组织块周边爬出来，多呈现三角形的贴壁生长细胞（图1A），转板培养后1和6d，细胞胞体较小，呈三角形或多边形（图1B,C），转板培养12d，细胞胞体增大，梭形，或伸出较长的伪足（图1D）。
2.2培养液中活性TGFβ1的浓度 12d的TGFβ1水平（427.2±41.3ag/细胞）明显高于1d（75.5±13.2ag/细胞）和6d（99.0±16.1ag/细胞）的水平，差异均有统计学意义（P<0.05），且随着时间的延长TGFβ1的浓度水平有逐渐上升的趋势。
2.3细胞αSMA的表达 转板后1d的细胞胞体小，几乎没有胞质呈棕黄色的阳性细胞（图2A），6d的大部分细胞胞体小，可见少数胞质着棕黄色的阳性细胞（图2B），转板后12d的细胞，可见大部分胞质着棕黄色的肥大梭形细胞（图2C）。12d的αSMA的表达水平（0.0972±0.0269）分别高于1d（0.0010±0.0018）和6d（0.0095±0.0114）的水平，差异均有统计学意义（P<0.05），而且随着时间的延长，αSMA的表达量有逐渐增加的趋势。不同时间活性TGFβ1浓度对细胞表达αSMA量的对应关系的直线回归方程为：y=0.0003x0.0142(t=17.460，P<0.01，图3)。
图2 LEC的αSMA表达（P×200）（略）
A：转板培养1d；B：转板培养6d；C：转板培养12d
图3 回归直线（略）
3讨论
存在于哺乳动物体内的TGFβ家族包括有TGFβ1，β2，β3。一般来说TGFβ亚型表现非常相似的活性。TGFβ1是一种普遍存在的致纤维化生长因子，正常情况下TGFβ1在房水、晶状体和玻璃体中均有表达，通常以无活性的复合物形式存在。它能够促进细胞的迁移，异常增生，显著下调细胞的缝隙连接蛋白43的表达，促进了细胞外基质FN和整合素β的过渡表达，促使了上皮间质转分化（epithelialmesenchymal transdifferentiation,EMT）。EMT是上皮源性细胞在某种特定条件下发生迁移、变形、增生并转化为表达平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin,SMA）等间充质来源细胞类型的现象，从而参与了胚胎发育早期、创伤修复、免疫调节、肿瘤的发生等多种生物过程。Latvala等[1]在后发性白内障和前囊膜白内障中用TGFβ1的多克隆抗体免疫标记出类似于成肌纤维细胞的梭状细胞，它表达有弹性蛋白，细胞角蛋白8和a平滑肌肌动蛋白。这说明它们对白内障的形成有一定的作用。McAvoy等[2]也通过动物实验研究模型表明：直接将活性TGFβ注射到成熟大鼠眼部玻璃体中和通过生产过表达TGFβ的转基因小鼠，晶状体都发生了白内障样的改变，出现了晶状体皮质的混浊和囊膜下的斑块，表现在细胞正常结构的破环和纤维化的形成。Lovicu等[3]研究晶状体中过渡表达TGFβ的转基因小鼠，也发现成人前囊膜下板块和纤维物质间形成一层新的上皮样层。所有成人前囊膜下白内障的标志物，如Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白，在转基因小鼠模型和TGFβ1诱导培养大鼠晶状体细胞中都有表达，呈现纤维母细胞表型。表明前囊膜下白内障和后发性白内障可能都是通过TGFβ诱导的EMT机制发生的。有研究表明，晶状体上皮细胞在受到免疫、创伤和手术等的刺激后类似于大多数组织的创伤愈合反应，正常存在于晶状体和其周围环境的TGFβ1由潜伏状态转为了成熟状态，并与晶状体上皮细胞的受体相结合发挥生物作用。Delongh等[4]研究发现，EMT机制是晶状体上皮细胞创伤愈合反应的一部分，晶状体上皮细胞特征性表达多种细胞外基质蛋白、如层粘连蛋白、Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、蛋白聚糖等，以及中间丝成份如连接蛋白、a平滑肌肌动蛋白和不同的整合素亚型（a2，a5，a7B），同时上皮基因的缺失如Pax6, Cx43, CP49, a晶状体球蛋白, E钙粘蛋白, 紧密连接蛋白ZO1。
目前，普遍认为Smad通路是EMT的主要信号途径。TGFβ特异性高亲和力地结合到细胞表面的受体上，Smad2和Smad3被TGFβ受体Ⅰ型激酶激活后和Smad4一起磷酸化。Saika等[5]研究认为，Smad3是TGFβ下游的关键信号转导元件和激活素受体，TGFβ抗体可以阻断其活化。TGFβ在体外培养的原代晶状体上皮细胞EMT和体内创伤诱发的EMT都通过Smad3信号通路起作用[6]。敲除Smad3可以阻断晶状体上皮细胞EMT。可见Smad信号通路可能是抑制白内障的作用新靶点。在本研究中，原代培养的晶状体上皮细胞活性TGFβ1的量逐渐增多，而且细胞表达αSMA的量也随着增加。说明体外培养的晶状体上皮细胞类似于免疫、创伤和手术等引起的白内障的晶状体上皮细胞，在大量活性TGFβ1的作用下逐渐发生了上皮间质转分化。本实验中原代培养晶状体上皮细胞所发生的状态变化正好模拟了白内障术后后发性白内障的细胞状态，有利于促进后发性白内障的细胞分子生物学防治研究的发展[7]。
【参考文献】
1 Latvala T, Uusitalo M, Puolakkainen P, et al. Immunolocalization of transforming growth factorβl and tenascin in human secondary cataract. Acta Ophthalmol Scand2000;78:344347
2 McAvoy JW, Chamberlain CG, de Iongh RU, et al. Peter Bishop Lecture: Growth factors in lens development and cataract: key roles for fibroblast growth factor and TGFb. Clin and Exp Ophthalmol2000;28:133139
3 Lovicu FJ, Schulz MW, Hales AM, et al. TGFbeta induces morphological and molecular changes similar to human anterior subcapsular cataract. Br J Ophthalmol2002;86:220226
4 delongh RU,Wederell E,Lovicu FJ, et al. Transforming growth factorbetainduced epithelialmesenchymal transition in the lens: A model for cataract formation. Cells Tissues Organs2005;179(12):4355
5 Saika S,KonoSaika S,Ohnishi Y, et al. Smad3 signaling is required for epithelialmesenchymal transition of lens epithelium after injury. Am J Pathol 2004;164:651663
6熊全臣,张璐琰,郑玉萍,等.鼠晶状体上皮细胞的体外培养.国际眼科杂志2008;8(3):494495
7刘红玲,张晓梅,关风.晶状体后囊膜混浊的研究方法及细胞生物学研究进展.国际眼科杂志 2007;7(2):457459 |
