作者：刘红玲
作者单位：（150001）中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第一医院眼科
【摘要】目的：研究兔晶状体上皮细胞和人胚肺成纤维细胞在雷帕霉素联合可降解高分子材料PLGA涂层的人工晶状体表面的生长分布状况，为将雷帕霉素涂层人工晶状体植入体内抑制后发性白内障奠定基础。
方法：采用专利技术将雷帕霉素联合PLGA或单独PLGA作为对照组喷涂至人工晶状体光学区的外围，制备出药物涂层人工晶状体。将兔晶状体上皮细胞和人胚肺成纤维细胞悬液（3×105）分别接种于人工晶状体的表面，雷帕霉素+PLGA涂层人工晶状体组(与兔晶状体上皮细胞同培养的为A组，与人胚肺成纤维细胞共培养的为a组)，高分子材料PLGA组(B和b)，普通人工晶状体组(C和c )，对人工晶状体表面不同区域细胞的分布疏密程度进行分级，应用MTT法对人工晶状体表面的细胞数量进行间接计数。
结果：雷帕霉素+PLGA或PLGA能够均匀地喷涂在人工晶状体的外周，无涂层的开裂。无论是直接通过相差显微镜下对细胞分布疏密进行分级还是MTT法间接计数活细胞数量，两种细胞在6组人工晶状体表面分布不同，A和a组细胞数量明显减少，与其它组相比具有统计学意义（P<0.05），B、b、C和c组相比细胞数量无统计学差异。各涂层人工晶状体表面涂层区和非涂层区域细胞分布无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）。
结论：将高分子缓释材料PLGA联合抗增殖药物雷帕霉素涂层至人工晶状体的外周制备出生物相容性佳的涂层人工晶状体，起到抑制兔晶状体上皮细胞和人胚肺成纤维细胞生长的作用，有望成为能够抑制后发性白内障发生的新型人工晶状体。
【关键词】 后发性白内障 雷帕霉素 聚乳酸 聚羟基酸 人工晶状体
0引言
目前，后发性白内障仍然是白内障超声乳化联合人工晶状体植入术后的最常见并发症之一。白内障术后残留的晶状体上皮细胞生物学行为发生变化，后囊膜进行性混浊，当累及到瞳孔区时，视力就会受到影响[1]。目前临床上治疗后发性白内障的常用方法是通过YAG后囊膜激光切除术，这一术式并不是完全的令人满意，它可以引起一过性眼内压增高，葡萄膜炎，黄斑囊样水肿，视网膜脱离，同时增加了白内障患者治疗的费用[25]，尤其是对于儿童白内障，严重的后囊膜增殖，无法通过YAG治疗后发性白内障。因此，在临床实践和实验性研究中，除了不断提高白内障手术技术，改进人工晶状体设计和材料之外，有多种类药物通过不同治疗途径用于防止后发性白内障的发生。雷帕霉素冠脉涂层支架在防治血管支架植入术后的再狭窄方面具有独特优势，在临床上广泛应用。我们将具有抗增殖、抗炎作用的第三代免疫抑制剂雷帕霉素联合可降解高分子材料聚乳酸 聚羟基酸(PLGA)制备出雷帕霉素涂层处理的人工晶状体。以兔晶状体上皮细胞、人成纤维细胞作为种子细胞体外观察其在涂层处理后的人工晶状体表面增殖、分布等情况，评价涂层后的人工晶状体的生物相容性。为雷帕霉素涂层的人工晶状体植入体内奠定基础。
1材料和方法
1.1雷帕霉素涂层处理人工晶状体的制备 表面处理工作由上海华东理工大学协助完成，在超净工作间内进行人工晶状体表面处理工作。人工晶状体采用聚甲基丙烯酸酯（poly methyl methacrylate , PMMA）（由苏州六六视觉提供Suzhou Medical Instrument General Factor），（Model OV55c,POWER(D)2.0,Optic 5.5mm,Length12.5mm）人工晶状体,雷帕霉素来自Sigma公司。采用专利技术将抗增殖药物雷帕霉素与10g/L PLGA( PLA∶PGA=80∶20)（1∶1）溶解于氯仿中后的混悬液采用静电喷涂沉积设备喷涂于人工晶状体光学区的外周(直径范围在4mm以外区域)，以免影响晶状体的透光性。高分子涂料在高压电场和辅助气压的共同作用下雾化成细小的颗粒,沉积在人工晶状体表面。采用正交实验的方法确定最佳工艺条件。每个人工晶状体携带的雷帕霉素量为（20～40μg），厚度为10μm左右，制备出缓释雷帕霉素的涂层人工晶状体。高分子材料PLGA涂层人工晶状体作为对照组仅喷涂10g/L PLGA和氯仿混悬液。共30枚人工晶状体，分为6组，每组5枚，其中雷帕霉素涂层人工晶状体组(与兔晶状体上皮细胞共同培养的为A组，与人胚肺成纤维细胞共培养的为a组)，高分子材料PLGA组(B和b)，普通人工晶状体组(C和c )。将人工晶状体光学区域划分为8个区域（图1）。环氧乙烷消毒后备用。
1.2细胞的培养与传代
1.2.1组织块贴壁法培养兔晶状体上皮细胞（RLECs） 取4只刚断乳的健康新西兰兔，耳缘静脉注射过量利多卡因处死，无菌操作摘除眼球，剪净周围组织，浸入含1000U/mL庆大霉素的无菌盐水中10～15min。沿角膜缘剪除角膜，在手术显微镜下取出赤道部前的晶状体囊膜，剪成1mm2 的碎片，用吸管将其移入25mL 培养瓶中，摆布均匀，倒置于37℃含50mL/L CO2 培养箱中，组织块贴壁后向其中小心加入含200g/L胎牛血清的DMEM/F12培养液5mL，放入静置培养，培养1wk后，每3d换培养液1次。细胞融合后按1∶1或1∶2 传代。取第2、3代晶状体上皮细胞进行实验。
图1 人工晶状体分区示意图（略）
1 4区域为非涂层区域，5 8区域为涂层区域
1.2.2人胚肺成纤维细胞（HFL）的获取 人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast cell line,HFL1; american type culture collection) 购于中国科学院上海细胞所。细胞培养液为含100g/L(V/V)小牛血清、100万U/L青霉素和1.0×105g/L链霉素的溶液DMEM。细胞在培养箱内扩增后，经消化、分散，制成浓度为1.0×105 个/mL 细胞悬液作为种子细胞。
1.3细胞在人工晶状体表面的生长分布情况 取兔晶状体上皮细胞、人胚肺成纤维细胞悬液20μL（细胞浓度为3×105），接种于人工晶状体的表面，在37℃含50mL/L CO2 培养箱中沉降2h，再加入0.5mL的培养液，继续培养48h，以PBS冲洗三遍在相差显微镜下观察细胞在涂层区域和非涂层区域细胞分布的区别。细胞在人工晶状体表面的分布参照王桂琴[6]的分级标准进行分级：0级：人工晶状体表面无晶状体上皮细胞生长；1级：人工晶状体表面较少细胞分布，可以进行细胞计数；2级：人工晶状体表面较多细胞生长，较难进行细胞计数；3级：人工晶状体表面最多细胞生长，细胞极度密集。
1.4 MTT法检测细胞在人工晶状体表面的增殖情况 计数后的人工晶状体转移到无血清的400μL的DMEM/F12或DMEM培养液中，并加入配好的MTT 溶液(5g/L)40μL，在培养箱中继续培养2d。此过程中晶状体表面上的活细胞会与MTT 作用产生紫色还原产物，且该还原产物的量与活细胞数量成正比。紫色物质formazan用300μL DMSO溶解，作用4h，取200μL在96 孔板上测定其在570nm 处的光密度值(optical density,OD) ，每份样本设3个复孔，200μL DMSO作为空白对照组，结果以均值±标准差表示。
统计学处理：使用SPSS 13统计软件行统计学处理，细胞在人工晶状体表面分布资料采用多个独立样本非参数检验，组间比较采用两个独立样本的非参数检验，各组MTT法检测吸光值采用oneway方差分析（ANOVA），以P<0.05作为差异有统计学意义。
2结果
2.1人工晶状体表面的涂层处理 涂层后的人工晶状体大体（图2 A）观察可见涂层区域为半透明，界限清楚地分布在光学区的外周，表面光滑，制作工艺精细。涂层的人工晶状体与非涂层人工晶状体可以辨别。相差显微镜下（图2B）观察涂层人工晶状体表面涂层材料分布均匀，颗粒细小，无涂层的开裂和空缺。
图2 涂层后人工晶状体照片（略）
A：涂层后人工晶状体大体照片，涂层区域为人工晶状体的外周；B：相差显微镜下观察到的涂层部位，涂层颗粒均匀，细致
图3 光镜下观察体外原代培养的兔晶状体上皮细胞（略）
A：由前囊膜组织块周围伸展出晶状体上皮细胞×100；B：传代后的晶状体细胞呈单层的多角形平铺×100
2.2细胞的培养、传代与获取
2.2.1兔晶状体上皮细胞的培养与传代 由兔晶状体前囊膜碎片的周围爬行出原代的晶状体上皮细胞，细胞形态呈多角形，细胞透明(图3A)。约1wk左右即可爬满瓶底。传1代细胞生长状态良好，细胞较规整呈扁平多边形结构（图3B）。随着传代次数的增加，培养时间的延长细胞的生长逐渐缓慢，形态接近成纤维细胞。
2.3细胞在人工晶状体表面的分布情况
2.3.1兔晶状体上皮细胞在人工晶状体表面分布情况 兔晶状体上皮细胞在三组人工晶状体的表面的分布明显不同（表1），差异具有统计学意义（KruskalWallis test χ2=77.38,P=0.000）。A组的人工晶状体表面的细胞分布表现以无细胞生长为主，有少数为少量细胞生长。A组与B组或C组相比差异具有统计学意义（χ2=57.22,P=0.000，χ2=56.94,P=0.000）。B组及C组晶状体表面的细胞分部密集，细胞分布主要以2、3级为主，较难进行细胞计数，B组与C组相比无统计学差异(χ2=0.813，P=0.846）。同一晶状体的1～4区域与5～8区域即人工晶状体的外围与中央细胞分布无统计学差别（mannwhitney U test P=0.799，P=0.547, P=0.640）。细胞可以骑跨在涂层区域和非涂层区域之间生长。
2.3.2人胚肺成纤维细胞在人工晶状体表面的生长 人胚肺成纤维细胞在三组人工晶状体的表面分布明显不同，差异有统计学意义（KruskalWallis Test χ2=95.041，P=0.000）。在雷帕霉素涂层处理组（a组）细胞生长稀疏，便于进行计数（图4A），在高分子PLGA组（b组）和普通空白人工晶状体组（c组）表面细胞生长密集，细胞数量无法进行计数（图4B，表2）。a组与b组或c组相比差异有统计学意义（χ2=65.235，P=0.000;χ2=67.326,P=0.000）。b组和c组细胞分布差别无统计学意义（χ2=0.775，P=0.856）。同一晶状体的1～4区域与5～8区域即人工晶状体的外围与中央细胞分布无统计学差别（mannwhitney U test P=0.799,P=0.799,P=0.799）。
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