作者：苏凡凡，张明昌
作者单位：(430022)中国湖北省武汉市,华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科
【摘要】目的：探讨姜黄素（curcumin）对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization, CNV）形成的影响及CNV形成过程中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis, iNOS）的表达情况。方法：以碱烧伤建立角膜新生血管模型，采用裂隙灯照相、免疫组化和RTPCR等方法分别检测使用姜黄素前后各时期角膜组织中VEGF和iNOS的表达情况，并进行统计学分析。结果：姜黄素结膜下注射组角膜新生血管面积明显减少（t值分别为4.453，4.440，3.887，4.718，3.585，P<0.05）；免疫组化染色，VEGF和iNOS在正常角膜上皮基底细胞有弱表达，新生血管对照组表达明显增强，其表达主要分布在新生血管形成区域和上皮全层；结膜下注射组表达明显减少；VEGFmRNA和蛋白表达一致。结论：姜黄素可以有效抑制角膜新生血管的发生，其机制与降低角膜新生血管VEGF和iNOS有关。
【关键词】 姜黄素；角膜新生血管；血管内皮生长因子；诱导型一氧化氮合酶
Inhibitory effect of curcumin on rat corneal neovascularization
FanFan Su, MingChang Zhang
Department of Ophthalmology, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Correspondence to: MingChang Zhang. Department of Ophthalmology, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To observe the effect of curcumin on corneal neovascularization (CNV) in a rat model, and to explore the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and inducible nitric oxide synthesis (iNOS) in CNV. METHODS: CNV model was established by alkaline burning. The expressions of VEGF and iNOS in cornea of different period before and after using curcumin were detected by slitlamp biomicroscopy,photography,immunohistochemical staining and RTPCR. RESULTS: The area of CNV in subconjunctival injection with curcumin was decreased significantly. The expression of VEGF and iNOS in normal cornea endothelial basal cells was very weak; but there was strong expression in the region of CNV formation and all layers of cornea epithelium mainly in control group of CNV. The expression in the curcumin group was weakened markedly. There was the concordance of VEGFmRNA and its protein.CONCLUSION: Curcumin can effectively inhibit corneal neovascularization though inhibiting the expression of VEGF and iNOS.
KEYWORDS: curcumin; corneal neovascularization; VEGF; iNOS
0引言
正常角膜组织是没有血管的，角膜的无血管化是维持其透明性的重要因素之一。角膜新生血管(corneal neovascularization ,CNV)是在缺氧、炎症、损伤等多种有害刺激下从角膜缘血管网形成的新生毛细血管侵入角膜而形成。角膜新生血管常导致角膜失去透明性，是致盲的一个重要原因，也是角膜移植排斥反应发生的高危因素，目前尚无理想的治疗方法。姜黄素是从中药姜黄根中提取的一种酚类化合物，是姜黄的主要活性成分，具有降压、抗凝、抗炎、降血脂等作用。近年来实验表明：姜黄素还具有抗肿瘤血管生成作用。故我们研究姜黄素对大鼠角膜新生血管的影响。
1材料和方法
1.1材料
Wistar大鼠36只，购自同济医学院动物房，雌雄不限，约150~200g，健康无眼疾，随机分为3组：正常阴性对照组A 6只，角膜不作任何处理；其余30只左眼作为CNV实验对照组B，右眼作为CNV实验干预组C。于模型建立后1d开始C组每天结膜下注射一定浓度姜黄素溶液，B组给于生理盐水。各组动物分别在造模后1,4,7,14,21d断颈处死，立即取角膜组织。姜黄素为原料药粉剂，购自Sigma公司；RTPCR试剂盒及PCR反应试剂均购自武汉凌飞公司，免疫组化试剂及方法由同济医学院免疫教研组提供。用水合氯醛3mL/kg，ip全身麻醉后,用地卡因滴眼液表面麻醉后将直径3.0mm滤纸浸入1mol/L氢氧化钠溶液中1min ,贴敷角膜中央20s 后取下,用生理盐水充分冲洗结膜囊1min。所有实验对象均选左眼，右眼作为第2d起即用氯霉素滴眼液点眼，预防感染。
1.2方法
以少量DMSO助溶，用生理盐水制备成10，20，40，80μmol/L的溶液。根据已作各种浓度姜黄素溶液对大鼠CNV影响作用比较的实验，发现40μmol/L姜黄素溶液对大鼠CNV影响作用比较明显，故本实验选用40μmol/L剂量作为实验组。每天在手术显微镜下观察B组和C组角膜新生血管生长情况，分别于造模后1,4,7,14和21d用数码相机对角膜新生血管进行拍照，测量长入角膜的新生血管长度（以连续且弯曲度小、并于角膜缘切线垂直的新生血管长度为准）。计算新生血管面积公式：S=C/12×3.1416×[R2（Rl）2 ]，S为角膜新生血管生长面积，C为角膜新生血管网的跨圆周钟点数，R为角膜半径，l为角膜新生血管长度。
1.2.1 VEGF和iNOS的表达检测
将快速取下的角膜组织石蜡包埋后，观察角膜新生血管生长情况，并进行免疫组化切片，观察VEGF和iNOS的表达。
1.2.2检测VEGFmRNA表达
参照Trizol试剂说明书提取总RNA，用紫外分光光度仪检测浓度和纯度，取总RNA 2μg，用RTPCR试剂盒进行反转录，PCR扩增VEGF，同时扩增βactin作为内参照。VEGF引物设计和PCR反应条件[1](上游引物序列：5’CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG3’,下游引物序列：5’GCACTCCAGGGCTTCATT3’,扩增产物大小为194bp；βactin作为内参照，上游引物为5’GAGCTATGAGCTGCCTGACG3’,下游引物为5’AGCACTTGCGGTCCACGATG3’，其扩增产物大小为406bp。)用GIS2008凝胶成像系统进行拍摄，软件分析，以VEGF目的条带与βactin条带光密度比值代表各产物的相对表达量。
统计学处理：各组数据均以 ±s表示，用SPSS 11.5数据包行独立样本t检验分析，P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1角膜新生血管生长面积
A组角膜碱烧伤后1，4，7，14及21d无新生血管的生长，B组1d角膜缘血管扩张，4d角膜缘扩张的血管处有新生血管芽长入，7d新生血管生长旺盛，粗大稠密且呈树枝状（图1A），可达角膜碱烧伤区域，14d新生血管面积达最高峰，交织成网，几乎遍布整个角膜（图1B），此后血管生长基本稳定，于21d部分小血管有消退。C组造模后第1d也可见角膜缘血管扩张，4d有新生血管长入透明角膜区，7d血管生长明显缓慢，细小稀疏（图1C），多集中于角膜缘，14d新生血管面积也有所增加，但未交织成网状，且可见大部分透明角膜（图1D），21d新生血管未向角膜中央发展，部分血管退化。在造模后1，4，7，14及21d t值分别为4.453，4.440，3.887，4.718，3.585，差异均有显著性（P＜0.05，表1）。表1大鼠碱烧伤角膜新生血管面积(略)
2.2角膜VEGF和iNOS的表达
正常阴性对照组A角膜组织中，VEGF没有表达或仅在上皮基底膜有微量表达（图2A），iNOS在正常角膜上皮基底膜及基质层有少量表达（图2B）。实验对照组B各个时期角膜全层VEGF表达增强，角膜上皮层及基质层内新生血管生长区域均可见棕色颗粒（图2C），iNOS在角膜上皮层浸润的炎性细胞胞角、基质层新生血管管腔及基质层浸润的炎性细胞胞浆阳性染色，呈棕色（图2D）。实验干预组C中VEGF和iNOS的表达在各个时期均较B组明显减弱，染色强度和阳性细胞率明显下降（图2E,F）。
2.3角膜VEGFmRNA的表达
在造模后7d，A组VEGFmRNA表达量很低，B组表达显著增加，条带最亮，C组表达较B组明显减少，条带较B组暗（图3）。A，B，C 3组7d的VEGFmRNA相对表达量分别是：0.244±0.374，1。037±0.120和0.493±0.054；B组较A组明显增高（t=15.428，P＜0.05)，C组较B组明显减少（t=10.126，P＜0.05)。
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