余克明 刘璇 叶一明 李凡 葛坚 庄菁

　　中山大学中山眼科中心国家重点实验室 510060

　　目的：探讨视网膜神经细胞中Ku和BRCA1基因沉默的分子机制是否与其启动子的甲基化有关;去甲基化后是否会影响其DNA修复能力。

　　方法：原代培养SD乳鼠视网膜神经细胞，MAP2鉴定其纯度。0.5，1.0，2.0μM 5-Aza-CdR(对照组不加)处理，72h后提取总RNA，RT-PCR检测5-Aza-CdR对Ku表达的影响;提取总蛋白检测Ku的表达;倒置显微镜下拍照，比较不同组间节细胞突起长度差异。原代培养纯化后的SD乳鼠视网膜神经节细胞(RGCs)，5-Aza-CdR 处理72h，无血清培养6h，恢复完全培养液，提取DNA，检测DNA的完整性。Real time PCR进一步检测5-Aza-CdR对原代培养纯化后的SD乳鼠RGCs BRCA1表达的影响。提取原代培养RGCs的DNA通过甲基化敏感性限制性内切酶PCR法检测BRCA1启动子的甲基化情况。

　　结果：所培养视网膜细胞中，MAP2阳性细胞87%以上。普通光镜下观察纯化后的SD乳鼠RGCs，5-Aza-CdR处理组轴突长度较对照组缩短。DNA电泳显示，5-Aza-CdR促进RGCs DNA的修复，染色体DNA更完整。RT-PCR、Western Blot显示，5-Aza-CdR处理的视网膜神经细胞中，Ku的mRNA及蛋白表达较对照组有明显增加。Real time PCR显示，加5-Aza-CdR处理的RGCs BRCA1 mRNA的表达较对照组明显增加。DNA酶切及PCR验证了RGCs BRCA1的启动子中两个HapII的酶切位点发生了甲基化。

　　结论：终末分化视网膜神经细胞中Ku和BRCA1的沉默与其启动子甲基化有关，去甲基化可促进视网膜神经细胞DNA的损伤修复。