金冲飞 姚克

　　浙江大学医学院附属第二医院 310009

　　目的：先前我们报道了先天性白内障致病基因(MIP基因)上的一例剪接位点的突变，本文主要阐述minigene技术在研究剪接位点突变所导致的下游功能变化中的应用。

　　方法：分别以正常人和病人的基因组DNA为模版，扩增包含3号外显子、3号内含子和4号外显子在内的完整基因片段，用哺乳细胞表达载体pTARGET分别构建包含以上基因片段的minigene(正常minigene和突变minigene)。分别将正常minigene和突变minigene以及空的pTARGET质粒转染至HeLa细胞和晶状体上皮细胞(LECs)。培养48小时后提取总RNA，逆转录后，以载体特异性引物扩增目播相应的转录片段，并用跑胶和测序的方法验证其PCR产物。

　　结果：跑胶结果显示正常minigene的剪接产物对应于687bp条带，测序证实为正常剪接产物;而突变minigene的剪接产物对应于327bp条带，测序结果显示，突变激活了一个位于3’非翻译区的一个隐性剪接位点，导致了错位的剪接。

　　结论：通过minigene技术，我们发现了MIP基因上位于3’非翻译区的一个国内外均未见报道隐性剪接位点。在无法获得突变相关的mRNA时，Minigene技术提供了一个很好的研究错位剪接的工具。