【摘要】 目的：观察两种选择性环氧化酶2(COX2)抑制剂对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖和凋亡的影响，并比较两者作用强弱，寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新途径。方法：用0～200μmol/L尼美舒利(nimesulide)和美洛昔康(meloxicam)作用体外培养的HPF,24～96h后观察不同浓度的两种药物对HPF的影响。MTT法及免疫组织化学染色增生细胞核抗原(PCNA)检测细胞生长活性,流式细胞仪测定细胞周期时相变化。 结果：在尼美舒利50μmol/L作用24h后，美洛昔康100μmol/L作用24h后均能显著抑制HPF的增殖(P<0.05)，呈剂量和时间依赖性。100μmol/L尼美舒利和美洛昔康分别作用48h后,流式细胞仪检测结果发现,药物作用组均出现典型的亚二倍体凋亡峰，G0/G1期细胞百分比上升(P<0.05)，S期细胞百分比下降(P<0.05),说明细胞阻滞于G0/G1期。当尼美舒利的浓度在25～200μmol/L，美洛昔康在50～200μmol/L范围内能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P<0.05)。结论：两种选择性COX2抑制剂均能抑制HPF的生长，并诱导其调亡，对COX2的选择性越高，对HPF的抑制作用越强，尼美舒利的作用强于美洛昔康。
【关键词】 翼状胬肉;成纤维细胞;选择性环氧化酶2抑制剂; 尼美舒利;美洛昔康
Investigation of two selective cyclooxygenase2 inhibitors on HPF
Yuan Gao, XuKang Cheng, Dan Chen
Department of Ophthalmology, the First Hospital of Wuhan, Wuhan 430022, Hubei Province, China
AbstractAIM: To investigate the effect of two selective cyclooxygenase2 (COX2) inhibitors (nimesulide and meloxicam)on proliferation and apoptosis of human pterygium fibroblasts (HPF) in culture and search for a new method to prevent the recurrence after pterygium surgery.METHODS: HPF was incubated with 0200μmol/L nimesulide and meloxicam for 2496 hours. The MTT method was used to assay the biologic activities of the two drugs in different time and different doses. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in each group was detected by immunohistochemistry method. The cell cycle distribution was measured by flow cytometic analysis.RESULTS: Administration of 50μmol/L nimesulide or 100μmol/L meloxicam for 24 hours significantly inhibited HPF proliferation in a doseand timedependent manner (P<0.05). After treated with the two drugs in 100μmol/L for 48 hours, there was significant subG1 peak. The number of HPF in G0/G1 phase increased, but in S phase decreased (P<0.05), suggesting cells were arrested in G0/G1 phase. The nimesulide (25200μmol/L) and meloxicam (50200μmol/L) inhibited the expression of PCNA in HPF in a dosedependent manner (P<0.05).CONCLUSION:Two selective COX2 inhibitors can significantly inhibit HPF proliferation and induce its apoptosis. The higher selecti on of COX2 has the stronger inhibition on the growth of HPF.
KEYWORDS; pterygium; human pterygium fibroblasts; selective cyclooxygenase2 inhibitor; nimesulide; meloxicam
0引言
翼状胬肉是眼表疾病的常见病，多发病。目前对该病的发病机制还不是特别清楚，甚至不同学说之间还存在矛盾。临床治疗疗效也不尽如人意，复发率较高。因此探讨翼状胬肉的发病机制并寻找出有效的，毒副作用少的药物抑制其发生发展，降低其复发率已经成为大家所关注的话题。环氧化酶2(COX2)在炎症发生和肿瘤细胞增殖中的作用已经受到越来越多的重视，而有研究发现翼状胬肉成纤维细胞(HPF)中也存在COX2的表达。我们探讨选择性COX2抑制剂尼美舒利(nimesulide)和美洛昔康(meloxicam)对体外增殖的成纤维细胞抑制作用，并对两种药物进行比较，为其用于翼状胬肉的治疗和术后预防复发提供前期实验资料。表1 尼美舒利和美洛昔康对HPF增殖的影响aP<0.05，bP<0.01 vs阴性对照组; cP<0.05 vs同种药物与临近低浓度组;eP<0.05 vs尼美相同浓度相同时间。
1材料和方法
1.1材料 主要试剂：DMEM培养基，新生牛血清，胰酶为Gibco公司产品。DMSO，MTT，尼美舒利，美洛昔康为Sigma公司产品。小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体，小鼠抗人PCNA单克隆抗体，羊抗鼠IgG为武汉博士德公司产品。仪器设备： SHEL LAB CO2培养箱(Sheldon公司)，倒置显微镜(OLYMPAS)，DG3022A型酶联免疫检测仪，流式细胞仪(FACS，美国BD公司)。
1.2方法 实验可分为如下步骤：(1)体外细胞培养：利用组织块培养法采用含200g/L小牛血清的DMEM培养基将细胞常规培养于温箱中。待原代贴壁培养生长至基本汇满培养瓶瓶底时用2.5g/L的胰酶消化，按1∶2的继续传代培养，取第三代或第四代细胞用于实验。制备细胞爬片，SP法染色进行鉴定。(2)尼美舒利和美洛昔康对HPF的影响：将消化好的第四代HPF按4×104/mL转移到96孔板内，共设六组，每组设复孔4孔，培养24h待细胞贴壁后加药。尼美舒利设阴性对照组，25，50，100，200μmol/L，另一组为空白对照用于调零。分别继续培养24，48，72，96h。吸去上清，各孔加MTT 20μL，孵育4h，加120μL DMSO，振荡后用酶标仪测490nm处吸光度值(A)。美洛昔康方法及浓度同上，实验组细胞抑制率(Inhibitory Rate, IR)=(阴性对照组平均A值—处理组平均A值)/阴性对照组平均A值×100%。(3)流式细胞仪检测细胞周期分布及调亡情况：取100μmol/L尼美舒利和美洛昔康分别处理48h后的实验组及对照组(不加药)细胞，每组各3瓶标本，PBS洗涤后，加入700mL/L冷乙醇固定，离心后PI染液4℃染色30min,用流式细胞仪检测，选用488nm激发波长测定样本。(4)PCNA的检测:做6孔板细胞爬片后用25,50,100, 200μmol/L的尼美舒利和美洛昔康分别作用48h，对照组不加药。免疫组织化学SABC法染色检测PCNA的表达。随机计数(放大倍率20×10)100个细胞数出全部阳性细胞及阴性细胞并列表。
统计学分析：本实验数据均以均值±标准差(±s)表示，均数之间的比较采用两样本比较的t检验，用SPSS 10.0软件包处理数据。
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