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2结果
2.1 HPF免疫组织化学鉴定 体外培养的翼状胬肉细胞经SP法染色可见波形蛋白表达阳性，阳性表达位于胞质，呈现与图1 不同浓度尼美舒利和美洛昔康对HPF的抑制作用。表2 FCM分析100μmol/L尼美和美洛作用48h对细胞周期的影响aP<0.05 vs阴性对照组;cP<0.05 vs尼美舒利。成纤维细胞长轴方向一致棕黄色束状或网状结构;细胞角蛋白表达阴性。
2.2尼美舒利和美洛昔康对HPF增生的影响 MTT结果见表1，对照组细胞增殖旺盛，密集，束状排列，形态规则，胞体饱满，用药组细胞胞体缩小，形态不规则，胞间隔宽，高剂量组细胞明显减少。尼美舒利50μmol/L作用24h，美洛昔康100μmol/L作用24h后均能显著抑制HPF的增殖，两种药物同浓度同时间作用均有差异。尼美舒利和美洛昔康对HPF增殖的抑制均呈剂量和时间依赖性见图1，尼美舒利的抑制作用明显强于美洛昔康。
2.3尼美舒利和美洛昔康对细胞周期的影响 流式细胞仪的结果见表2，两种药物作用后，均可见G0/G1期细胞百分数增加，S期细胞百分数减少，说明细胞阻滞于G0/G1期，进入DNA合成期的细胞减少。
2.4尼美舒利和美洛昔康对细胞表达PCNA的影响 细胞阳性表达显示为棕黄色、黄色或浅黄色细小均匀颗粒,分布于整个细胞核;细胞核无着色、胞质呈淡黄色者为阴性。当尼美舒利浓度≥25μmol/L，美洛昔康浓度≥50μmol/L即能浓度依赖性的抑制HPF表达PCNA(P<0.05)，两组药之间有显著差异，且尼美舒利的作用强于美洛昔康(表3)。表3 48h尼美舒利和美洛昔康对HPF表达PCNA的影响aP<0.05 vs阴性对照组，cP<0.05 vs尼美舒利相同浓度，eP<0.05 vs同种药物临近低浓度。
3讨论
翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织呈三角形膜样增生而侵犯角膜的一种眼表疾病,单眼或双眼受累。不仅直接影响美观, 还可由于牵拉而引起眼部不适及角膜散光, 严重者影响视力及不同程度地影响眼球运动。Hill等[1]通过病理研究发现翼状胬肉的主要成分是成纤维细胞，细胞的异常增殖和新生血管的生成导致相应的病变。成纤维细胞在翼状胬肉发病机制中起免疫原始靶细胞的作用。角膜缘干细胞移植加羊膜移植虽能有效降低复发率，但也不能彻底解决该问题。一些辅助疗法，对于本病的治疗及复发的防治取得了一定效果，但并不十分理想，有时还会出现严重的并发症。所以，寻找安全有效的药物来抑制HPF的增殖是许多学者所面临的研究课题。环氧化酶(cyclooxygenase ,COX) 又名前列腺素内过氧化物合成酶,是前列腺素合成的限速酶，它能将花生四烯酸催化合成各种前列腺素产物,后者参与维持机体各种生理和病理过程。环氧化酶有两种同工酶COX1和COX2，COX1是一种持续表达的结构型酶,被喻为“管家酶”，在大多数正常组织中稳定表达，参与机体正常生理过程和保护功能。而COX2是诱导型酶,在生理状态下COX2在多数组织中处于静息状态或低表达,而在病理情况下,当细胞接受相应的刺激如生长因子、细胞因子( IL1，TNF，TGF，PDGF，PAF)、血清脂多糖(LPS)、促肿瘤剂(如佛波酯等)、内皮素、高渗状态等[2]时，COX2的mRNA和蛋白很快增加，活性增高，参与炎症、损伤、修复、新生血管的生成及肿瘤的生长和转移。近年来，COX2在眼部疾病发生发展中的作用被越来越多的学者所重视。眼部疾病中，角膜炎，翼状胬肉，虹膜炎，青光眼，白内障，糖尿病视网膜病变，早产儿视网膜病变中均可见COX2的异常表达。COX2参与眼部炎症和新生血管的形成[38]。选择性COX2抑制剂在抑制致炎前列腺素合成的同时并不抑制生理性前列腺素的合成[9]，因此这类药物用于治疗时不良反应很少，近年来被广泛的应用于临床。COX2抑制剂可能是通过抑制COX2减少PGE2的生成以及降低MAPK(ERK2)的活性[10]，从而抑制细胞的增殖。本实验结果显示尼美舒利和美洛昔康均能显著抑制HPF的增殖，而且呈剂量和时间依赖性。这两种选择性COX2抑制剂，因其化学结构不同，对COX2的选择性也有所不同。有文献报道尼美舒利对COX2选择性抑制的强度是美洛昔康的8倍[11]，对COX2的选择性更高。本实验结果显示尼美舒利对HPF的抑制作用是强于美洛昔康的，这表明COX2抑制剂对HPF生长的抑制作用主要是通过抑制COX2而实现的。流式细胞仪检测到两种药物作用后，G0/G1期细胞百分数增加，DNA合成减少，从而引起细胞的凋亡。选择性COX2抑制剂诱导凋亡的可能机制包括抑制PGE2的生成,下调bcl2蛋白,抑制突变的Hras，Kiras的水平,上调caspase3的活性,抑制IκBα的磷酸化,抑制TNFκB的激活,促TNFα诱导的细胞凋亡[12]。PCNA是一种酸性细胞周期蛋白,是DNA聚合的辅助因子,细胞内外的增殖信号必须经过PCNA参与才能引发DNA的合成[13]。因此,PCNA主要反映了细胞的增殖能力，已被认为是一种准确，直观，简便的衡量细胞增生状况的指标。经两种选择性COX2抑制剂作用,HPF中PCNA的表达下降,表明HPF增殖减慢，生长受到抑制，高选择性COX2抑制尼美舒利对PCNA表达的抑制作用明显一些，与MTT和流式细胞仪结果一致。
本实验表明选择性COX2抑制剂在治疗翼状胬肉方面有适用前景，但是也不能忽略COX2可能在炎症转归和损伤修复中可能存在着正性的作用，如何把握好两者间的平衡点，更好的利用COX2抑制再生，促进修复是有待解决的问题。
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