【摘要】 目的：研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)损伤后相邻感光细胞和脉络膜血管的病理变化。方法：机械性刷除青紫蓝兔眼底髓线上方的RPE细胞，观察术后7，14，30d和90d清除区相邻感光细胞和脉络膜血管变化。结果：RPE细胞清除术后相邻的感光细胞发生退行性改变和死亡，脉络膜毛细血管萎缩。结论：RPE清除术可模拟萎缩型年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration, AMD)及渗出型AMD剥膜以后的病理变化，为自体RPE移植挽救损伤的感光细胞的实验提供了良好的动物模型。
【关键词】 视网膜色素上皮 感光细胞 脉络膜毛细血管 黄斑变性
Histopathological changes of photoreceptors and choroids after retinal pigment epithelium debridements
TaoRan Zhang,YunTao Hu, Ying Li, JianGuo Wu, YanLing Wang, ZhiZhong Ma
Foundation items: National Key Basic Research and Development Plan of China (973 Program)(No.2007CB512203);Key Clinical Projects of the Third Hospital of Beijing University(No.YLZD09604)
Department of Ophthalmology,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University,Beijing 100050,China;Eye Center, Peking University,Beijing 100083,China
AbstractAIM: To create a retinal pigment epithelium(RPE) debridement animal model and observe the histopathological changes. METHODS: A brasive debridement of RPE was performed with a metal cannula after superior retinal bleb detachments in rabbits. Animals were examined by fundus fluorescein angiography(FFA)and indocyanine green angiography(ICGA)in seriate 7 days, 14 days, 1 month and 3 months postdebridements. And tissue sections were evaluated using light microscope and transmission electron microscope at corresponding time points.RESULTS: The debrided area was not completely resurfaced by surrounding elongated RPE cells;the choriocapillaries beneath the debrided area underwent degeneration;and the photoreceptors overlying the debrided area showed gradually degeneration and loss.CONCLUSION: The type of abrasive debridement has been suggested as a model of therapy for macular degeneration as there is a high correlation between RPE dropout, choriocapillaries atrophy and loss of photoreceptors function.
KEYWORDS: retinal pigment epithelium; photoreceptor cell; choriocapillary;macular degeneration
0 引言
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是来源于神经外胚层具有分泌功能的上皮细胞。虽然RPE没有感光及神经传导功能，但是对感光细胞的存活、脉络膜毛细血管的发育及这两者正常功能的维持是不可或缺的。年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration, AMD)的手术治疗不可避免的损伤RPE细胞。因此，在RPE移植的基础研究中，机械性损伤RPE是常用的动物模型。我们拟观察机械性损伤RPE细胞，即RPE清除术后相邻感光细胞和脉络膜血管的病理变化，为探讨自体RPE移植提供模型基础。
1 材料和方法
1.1 材料
成年青紫蓝兔(体质量3～3.5kg)19只，雌雄不限。术前散瞳检查排除眼底疾病。随机分为两组，手术组：16只，行RPE清除术，确定左眼为手术眼;正常组：3只，未做手术干预。所有动物由北京大学实验动物中心提供。图1 RPE清除术后1h FFA和ICGA A:FFA早期RPE清除区荧光渗漏(轮廓线)，^示脱离的视网膜;B：ICGA早期示RPE清除区内部分低荧光区(箭头);C：FFA晚期可见大量荧光渗漏;D：ICGA晚期未见明显荧光着染
1.2 手术
常规全身麻醉。三通道玻切切除上方玻璃体，用带注水的平针头(内径30G)在靠近锯齿缘处做人造视网膜裂孔，注入BSS，形成水分离性视网膜脱离，使脱离下缘达到髓线处，玻璃体切割头在裂孔处稍做视网膜切除，扩大裂孔，然后用带注水的硅胶黄斑刷在距视乳头上方1PD处做大约1.5～3PD大小的RPE清除术。以液流充分冲洗视网膜下被扫除的RPE细胞，玻切清除脱落的RPE细胞。气液交换平复视网膜(1只实验动物为做清除术后当时造影，未做气液交换)。缝合巩膜穿刺口，拔除灌注管，缝合球结膜。术后7，14，30d和90d间接检眼镜检查眼底。在上述各时间点耳缘静脉注射造影剂100g/L荧光素钠0.75mL/kg+ICG 4mg/kg，分别作荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)同步造影。在以上各时间点摘取眼球进行组织学检查。光镜:动物安乐死后，快速行眼球摘除术，角膜穿通后置于40g/L多聚甲醛+25g/L戊二醛溶液固定1h，去前节及残余玻璃体，置于上述固定液继续固定48～72h，常规HE染色，封片。电镜:动物注全身麻醉后，经左心室灌注40g/L多聚甲醛+25g/L戊二醛混合液(1∶1)500mL。快速摘除眼球，角膜穿通后置于PB缓冲25g/L戊二醛(4℃)固定40min，去前节，切除残余玻璃体，置于上述固定液继续固定过夜(4℃)。组织切成1mm3小块，经PB缓冲10g/L锇酸固定2h，脱水，包埋。半薄切片，对照定位后，60nm超薄切片。枸橼酸铅染色后，Philips TecnaiTM G220透射电镜观察，采集图像。
统计学分析：以外核层厚度变化衡量RPE清除术后感光细胞的损伤。分别测量距视盘2000，2250，2500μm处外核层厚度[1]，对RPE清除术后各时间点的外核层厚度与正常视网膜外核层厚度进行比较。统计方法使用SPSS 11.5软件中的协方差分析(P<0.05认为有显著性差异)。
2 结果
2.1 术中发现及术后并发症
术中RPE刷除后见清除区域色素脱失，Bruch膜裸露，透见下方脉络膜血流颜色。术后经间接检眼镜检查眼底，所有实验动物视网膜脱离均在术后7d内复位。在术后不同时间点清除区内或边缘均有不同程度的色素增殖移行。2只实验动物发生暴露性角膜干燥、角膜变性、雾状混浊，稍影响眼底观察。其中1只角膜混浊自发消退，1只持续混浊未愈。
2.2 FFA和ICGA
清除术后1h，FA造影早期出现透见荧光，随即发生荧光渗漏，持续至造影晚期;ICGA造影早期见损伤区内出现低荧光，晚期未见荧光渗漏(图1);清除术后7d，FA可见RPE清除区早期荧光充盈延迟，晚期出现荧光渗漏，ICGA见早期荧光延迟，清除区内低荧光(图2A，B);清除术后14d，FA见清除区内边界清楚的透见荧光，晚期亦无荧光渗漏，ICGA见RPE清除区内低荧光(图2C，D);清除术后30d和90d，FA见清除区内出现边界清楚的窗样缺损，暴露下方脉络膜大血管，巩膜反光增强，ICGA见与窗样缺损一致的低荧光区(图2E，F)。
2.3 组织学观察
2.3.1 光镜
RPE清除术后7d(图3A)可见清除区表面神经视网膜感光细胞外节崩解碎裂，外核层厚度正常，形态完整，脉络膜毛细血管减少;术后14d(图3B)清除区表面感光细胞外节几乎消失，仅残余内节，部分感光细胞损伤严重，外核层厚度稍有减少，脉络膜毛细血管管腔不明显;RPE清除术后30d，清除区表面感光细胞内节几近消失，外核层变薄，清除区下方脉络膜毛细血管闭塞;RPE清除术后90d(图3C)，清除区表面外核层几乎消失，仅残余少量感光细胞，向内核层移动，内核层细胞可辨，形态基本完好，视网膜下纤维增殖严重。
2.3.2 电镜
RPE清除术后14d(图4A)，感光细胞外节几近消失，在神经视网膜下形成崩解碎屑，感光细胞内节形态基本正常，有部分碎裂，清除区下方脉络膜毛细血管内皮窗孔消失，管腔缩小，毛细血管内皮细胞基底膜从Bruch膜上脱离，部分毛细血管萎缩;RPE清除术后30d(图4B)，清除区表面部分外界膜保持完整，感光细胞外节完全消失，内节残屑增加，这个时期，很少看到脉络膜毛细血管;RPE清除术后90d(图4C)，感光细胞结构消失，损伤的Bruch膜表面可见RPE缺失区，下方脉络膜毛细血管消失。
2.4 外核层形态学分析
时间和距离的交互作用无统计学意义，而且P=0.971，相当大，因此，可以认为不同测量地点对不同时间下测量得出的外核层厚度，无显著性的影响。在不同时间点测量的外核层厚度之间存在着显著性差异(F=526.914，P<0.01)。其中，除了正常对照组与损伤后7d(P=0.266)，正常对照组与损伤后14d(P=0.157)以及损伤后7d与损伤后14d(P=0.755)无显著性差异外，其他各组之间均有显著性差异，正常对照组与损伤后30d(P<0.01)，正常对照组与损伤后90d(P<0.01)，损伤后7d与损伤后30d(P<0.01)，损伤后7d与损伤后90d(P<0.01)，损伤后14d与损伤后30d(P<0.01)，损伤后14d与损伤后90d(P<0.01)，损伤后30d与损伤后90d(P<0.01)。而且，随着时间的迁移，外核层厚度呈现越来越薄的趋势(表1)。这提示：损伤早期，在损伤后14d内，外核层厚度与正常值之间无显著性差异(可能是由于细胞此时处于变性或者未完全坏死萎缩);而到中晚期，外核层厚度明显下降(说明RPE损伤后，导致了局部的感光细胞大量死亡)。RPE清除术后不同时间点实验动物外核层厚度比较(表1)。表1 RPE清除术后距视乳头不同时间点外核层厚度μm(略)
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