刘　斌　唐军民**　朱秀安　唐　岩**

　　(北京医科大学第三临床医学院眼科，**组织学与胚胎学系，北京　100083)

　　摘　要　为研究遗传性视网膜变性中感光细胞组织结构的时程变化及凋亡，对RCS(Royal College of Surgeons)大鼠及SD大鼠视网膜进行光镜观察和凋亡细胞 TUNEL (TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labeling)检测。结果表明，与同龄SD大鼠相比，RCS大鼠视网膜感光细胞从出生后15d开始，出现外节膜盘堆积；20d时，内节排列紊乱、消失；30d时，细胞核固缩，细胞消失；到出生后60 d，仅少许感光细胞保留；100 d时，几乎所有感光细胞消失。TUNEL检测，从出生后25 d开始，RCS大鼠视网膜有TUNEL呈阳性的感光细胞出现，35 d时达高峰。结果提示：RCS大鼠视网膜变性过程中，感光细胞逐渐出现结构异常，并以凋亡的形式死亡，出生后30～40 d是病变的高峰期。

　　关键词　感光细胞　细胞凋亡　遗传性视网膜变性　RCS大鼠

　　感光细胞(photoreceptor cell, PRC)变性是视网膜变性的主要病理改变，它是患者视力丧失的主要原因。目前，视网膜变性的发生机制尚不清楚，亦无有效防治方法。因此，研究视网膜PRC变性的发生发展，对人们了解视网膜变性的发生机制，寻找防治视网膜变性的途径具有十分重要的意义。RCS大鼠基因型为 rdy［1］，是研究常染色体隐性遗传性视网膜变性的经典动物模型。我们通过对不同鼠龄的RCS大鼠视网膜形态结构的光镜观察和凋亡细胞的检测，探讨了视网膜PRC变性的机制，为深入研究遗传性视网膜变性的发病机制提供一定的实验依据。

　　材料和方法

　　1.动物

　　RCS大鼠(美国Illinios大学提供)出生后9、15、20、25、30、35、40、60、80、100d各4只，雌雄不拘。12h光照(65～76 lux)/12h黑暗循环条件下饲养。同龄SD大鼠作正常对照。

　　2.视网膜形态结构的观察及凋亡细胞的检测

　　35%水合氯醛麻醉动物，摘眼球，去眼前节及玻璃体；4%中性甲醛固定24h，常规石蜡包埋；通过眼杯后极部的5μm厚矢状切片，间隔选3张切片行HE染色，光镜观察。相邻切片进行TUNEL检测［2］：切片常规脱蜡及下行至水；20mg/L的蛋白酶K(Sigma)消化组蛋白15min，以暴露DNA；3%过氧化氢30min以消除内源性过氧化酶。TdT酶(Sigma 公司产品)0.3mg/L，Bio-11-dUTP(B. M. 公司产品)0.01mmol/L反应体系，37℃，2h。TB缓冲液(30mmol/L枸橼酸钠，300mmol/L氯化钠)终止反应；正常血清封闭组织10min；加亲和素-辣根过氧化酶复合物，反应1h；DAB显色，常规封片。阴性对照片不加BIO-11-dUTP，阳性对照片在加酶反应体系前先用DNA酶1(Sigma 公司产品)1mg/L水解DNA。

　　结　果

　　1.RCS和SD大鼠PRC的生后发育

　　正常SD大鼠出生后9d，视网膜各层初具形态，但PRC内、外节很短；15d时，视网膜形态近正常，但PRC外节仍较短，一些细胞核含多个染色质块；20 d、25 d时，视网膜继续发育；到35 d时，视网膜已呈正常形态(图1)。至100d视网膜形态再无明显形态结构变化。与同龄SD大鼠相比，RCS大鼠出生后9 d，视网膜无明显不同；15 d时，外节开始增厚；20 d时，内节开始变窄，部分细胞内节消失，25 d时，少许PRC胞核形态及染色开始出现异常；30 d时，PRC胞核大小不一、开始减少、核固缩、染色加深，外节出现大量膜盘堆积、形态不规则，内节明显变短、排列紊乱、出现空泡；35 d时，浓缩的细胞核增加，有的细胞核染色质位于核边缘，视网膜外层可见少许类巨噬细胞；40 d时，PRC数量明显减少，外核层可见大量细胞核碎块，有较多的类巨噬细胞侵入至视网膜外层，视网膜色素上皮细胞开始出现排列紊乱，体积增大，外形不规则(图2)；60 d时，仅有少许PRC； 100 d时，几乎无PRC保留，剩余的残留物带已很窄，RPE层细胞增殖，排裂紊乱，并有毛细血管穿过，内核层、神经节细胞层基本正常(图3)。

　　图1　SD大鼠35 d视网膜，视网膜色素上皮层(A)、PRC外节(B)、PRC内节(C)、外核层(D)、内核层(E)及神经节细胞层(F)组织结构均正常。HE　×200

　　图2　RCS大鼠40 d视网膜，PRC外节层(B)增宽，排列紊乱，PRC内节层(C)变窄，出现空泡，外核层(D)明显变窄，散在细胞核碎块，视网膜色素上皮细胞(A)排列轻度紊乱，外核层和视杆视锥层可见类巨噬细胞的侵入(箭头)。HE　×200

　　图3　RCS大鼠100 d视网膜，RPE层(A)明显增殖，排列紊乱，PRC外节、内节层及外核层几乎消失，内核层(E)及神经节细胞层(F)保持基本正常结构。HE　×200

　　Fig.1 The retina of SD rat of 35 days old. The structure of retinal pigment epithelium (A), outer segment of PRC (B), inner segment of PRC (C), outer nuclear layer (D), inner nuclear layer (E) and ganglion cell layer (F) were all normal. HE ×200

　　Fig.2 The retina of RCS rat of 40 days old. The outer segment zone of PRC(B) became elongated and irregularly aligned. The inner segment zone of PRC(C) was shortened with vacuolation. The outer nuclear layer (D) was obviously thicken and had many nuclei debris. The retinal pigment epithelial cells (A) were slightly misaligned. A few macrophage-like cells invaded into the outer nuclear layer and rod or cone layer (arrow). HE ×200

　　Fig.3 The retina of RCS rat of 100 days old. The retinal pigment epithelial cells (A) proliferated and misaligned, the inner and outer segment zone of PRC, and the outer nuclear layer almost disappeared, the inner nuclear layer (E) and the ganalion cell layer (F) kept normal structure. HE ×200

　　2.TUNEL检测结果

　　各鼠龄SD大鼠视网膜均为阴性反应。RCS大鼠视网膜，从出生后25 d起，外核层的少许PRC胞核呈TUNEL反应阳性；30 d时，阳性细胞数增加；35 d时达高峰，部分胞核染色呈环状或呈均匀一致状(图4)；40 d时，阳性细胞数减少，染色多呈均一状。60 d时偶见阳性反应的细胞核，以后几乎检测不到。

　　Fig.4 The retina of RCS rat of 35 days old. Many nuclei of photorecptors were labeled (arrow) by TUNEL methods. TUNEL staining ×250

　　图4　RCS大鼠35 d视网膜，外核层有大量呈TUNEL染色阳性的细胞核(箭头)。TUNEL染色　×250

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