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2 结果
2.1 Tran的细胞毒性
HKCs与含Tran(100 μmol/L)的DMEM/F12培养基共培养24 h，测出的吸光值与吸光度组比值为(97±2.0)%，100 μmol/L的Tran对HKCs没有毒性。
2.2 Tran对rhCTGF刺激的HKCs形态的影响
倒置显微镜下观察，正常HKCs细胞为不规则椭圆形贴壁细胞,培养液中加入rhCTGF(20 ng/mL)48 h后，可见大部分细胞由椭圆形变为长梭形，rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组大部分细胞为椭圆形，少部分为梭形(图1：A～C)。
2.3 Tran对rhCTGF刺激的HKCs胶原Ⅳα1蛋白表达的影响
正常情况下，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达很少。20 ng/mL的rhCTGF刺激24 h，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达明显增强，与对照组比，有显著性差异(P<0.05)。曲尼司特(100 μmol/L)+rhCTGF(20 ng/mL)干预后，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达明显减少，与rhCTGF(20ng/ml)干预组比，有显著性差异(P<0.05)，见图2。
2.4 Tran对rhCTGF刺激的HKCs胶原Ⅳα1 mRNA表达的影响
用rhCTGF(20 ng/mL)刺激HKC细胞48 h，结果表明HKCs的胶原Ⅳα1 mRNA水平与βactin的电泳条带的光密度比值为0.54±0.05，对照组为0.18±0.03，有显著性差异(P<0.05)。rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组HKC细胞表达胶原Ⅳα1 mRNA水平为0.28±0.04，与rhCTGF(20ng/mL)干预组比，有显著性差异(P<0.05),见图3。
图3 曲尼司特对rhCTGF刺激的HKCs
表达胶原Ⅳα1 mRNA的影响
1.对照组; 2.rhCTGF(20 ng/mL)干预组;
3.rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组; 4.Marker。
2.5 Tran对rhCTGF刺激的HKCs表达胶原Ⅳα1蛋白的影响
用rhCTGF(20 ng/mL)刺激HKCs 48 h，胶原Ⅳα1蛋白表达明显增加，与对照组比,有显著性差异(P<0.05)。曲尼司特(100 μmol/L)干预后，胶原Ⅳα1蛋白的明显下降，与rhCTGF(20 ng/mL)干预组比，有显著性差异(P<0.05)(见图4)。
图4 Tran对rhCTGF刺激的HKC细胞
表达胶原Ⅳα1蛋白的影响
1.对照组;2.rhCTGF(20 ng/mL)干预组;3.rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组。
3 讨论
Tran是1982年由日本Kissei公司首先研发上市的一种新型的过敏介质阻释剂，临床上用来作为抗过敏药,预防和治疗各种变态反应性疾病。后来发现有明显的抗纤维化的作用，广泛用来治疗皮肤瘢痕疙瘩、硬皮病、血管成形术后再狭窄等。尤其抗肾脏纤维化方面，Tran可以减轻单侧输尿管梗阻模型(UUO)[4]、5/6肾切除模型[5]、糖尿病大鼠模型[6]的肾脏纤维化，起到明显肾保护作用。临床上有作者观察Tran可以减少早期糖尿病肾病的蛋白尿和尿中的胶原Ⅳ的排泄[7]。
Tran抗纤维化的机制主要是抑制包括肾间质成纤维细胞在内的多种细胞的TGFβ1的释放。在肾组织中，TGFβ1引起肾小管上皮细胞EMT、ECM的沉积，导致肾脏纤维化。然而，Tran具体发挥效应机制并不清楚。有报道Tran可能是抑制了TGFβ1磷酸化的Ⅰ型、Ⅱ型受体或受体酪氨酸激酶、受体苏氨酸激酶而发挥抗纤维化作用[8]。
CTGF是TGFβ1下游的致纤维化因子，可引起肾小管上皮细胞EMT、肾间质ECM的沉积，导致肾脏纤维化，Qi等用外源性大剂量的rhCTGF可引起肾小管上皮EMT和细胞外ECM的产生[9]。本实验中20 ng/mL的rhCTGF作用于HKCs 48 h后，倒置显微镜示HKC细胞大部分由正常的椭圆形变为梭形，发生了EMT，且HKCs胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白表达增多，胶原Ⅳα1是ECM的典型代表，说明rhCTGF引起HKCs的ECM产生。加入Tran后，HKC细胞大部分为正常的椭圆形，小部分为梭形，细胞胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白表达明显降低，说明曲尼司特能减少rhCTGF引起的ECM的沉积，这与Qi等[9]近期观察结果一致。至于Tran影响rhCTGF减少ECM的机制并不明确，或作用于某种黏附分子，或作用于细胞内CTGF的受体，国内外未见报道。
上述实验表明Tran抑制了TGFβ1、CTGF的产生，同时抑制肾小管上皮细胞EMT、减少ECM的沉积，而且对细胞的毒性小，用于临床抗过敏历史较久、副作用较少，可能被广泛用于临床治疗肾脏纤维化。
(文中图1～2见封三)
【参考文献】
[1]Border WA,Noble NA.TGFbeta in kidney fibrosis:a target for gene therapy[J].Kidney Int,1997,51(5):1 388-1 396.
[2]Esposito C,Patel A,Liu ZH,et al.Involvement of synthesis and degradation pathways of collagen type IV in human glomerulosclerosis: molecular analysis by in situ reverse transcription and competitive polymerase chain reaction[J].Contrib Nephrol,1996,118:12-16.
[3]Qi W,Twigg S,Chen X,et al.Integrated actions of transforming growth factorbeta1 and connective tissue growth factor in renal fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2005,288(4):F800-809.
[4]Miyajima A,Asano T,Asano T,et al.Tranilast ameliorates renal tubular damage in unilateral ureteral obstruction[J].J Urol,2001,165(5):1 714-1 718.
[5]Kelly DJ,Zhang Y,Gow R,et al.Tranilast attenuates structural and functional aspects of renal injury in the remnant kidney model[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(10):2 619-2 629.
[6]Akahori H,Ota T,Torita M,et al.Tranilast prevents the progression of experimental diabetic nephropathy through suppression of enhanced extracellular matrix gene expression[J].J Pharmacol Exp Ther,2005,314(2):514-521.
[7]Soma J,Sato K,Saito H,et al.Effect of tranilast in earlystage diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(10):2 795-2 799.
[8]Mifsud S,Kelly DJ,Qi W,et al.Intervention with tranilast attenuates renal pathology and albuminuria in advanced experimental diabetic nephropathy[J].Nephron Physiol,2003,95(4):p83-91.
[9]Qi W,Chen X,Twigg S,et al.Tranilast attenuates connective tissue growth factorinduced extracellular matrix accumulation in renal cells[J].Kidney Int,2006,69(6):989-995 上一页 [1] [2] |
