作者：王育红，胡义珍，曹 阳

    【摘要】  目的：研究转化生长因子（TGF-β2）和结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化中的作用。 方法：用不同浓度的TGF-β2刺激HTF，然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测CTGF和Fn的表达，用MTT法检测细胞的增殖。 结果：TGF-β2 2μg/L到5μg/L范围有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖，CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P <0.01),但0.5μg/L，1μg/L与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性，5μg/L与10μg/L增强细胞的增殖作用也无显著性差异（P >0.05）。 结论：TGF-β2能够明显地促进HTF细胞增殖，并增强其下游介质（CTGF）的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白（fibronetin, Fn）。

    【关键词】  结缔组织生长因子 转化生长因子-β2 纤维连接蛋白 Tenon囊成纤维细胞 青光眼滤过术

     0引言

    青光眼滤过术后滤过泡的瘢痕化是手术失败的关键原因，滤过泡瘢痕形成机制涉及很多生长因子，有研究表明与滤过手术联系最密切的则为转化生长因子TGF-β2[1]。结缔组织生长因子（CTGF）是继TGF-β之后发现的又一个重要的促纤维化因子，被认为是TGF-β的下游作用元件以及纤维化进程的启动因子[2]，其作用主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质(ECM)的合成[3]，针对CTGF的治疗有可能开辟一条仅特异作用于TGF-β引起的纤维化而不影响其他免疫活性作用发挥的新途径。有研究证实，TGF-β2能够刺激HTF产生CTGF[4]，但TGF-β2是否也具有相同的作用，这点在人体滤过泡的瘢痕化中仍未得到证实，因此，我们设计不同浓度的TGF-β2刺激的HTF细胞，看其是否能促进细胞的增殖，表达CTGF以及合成Fn，初步探讨CTGF在滤过泡瘢痕化中可能的作用。

    1材料和方法

    1.1材料  人重组TGF-β2蛋白（Peprotech，USA），鼠抗人Fn抗体（Santa cruz，USA），SP试剂盒（北京中杉），DAB试剂盒(武汉博士德)，羊抗人多克隆CTGF抗体（R&D,USA），羊抗兔二抗（武汉博士德），二甲基四氮唑盐（MTT）（Sigma，USA），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，USA），Trizol Reagent (Invitrogen, USA)，逆转录及PCR试剂盒(Progrema,USA)。以青光眼滤过术中取下的人Tenon囊筋膜组织,采用组织块贴壁培养法[5]培养人Tenon囊成纤维细胞。取3～6代对数生长期HTF进行实验。

    1.2方法  消化80%融合的细胞后，用含150g/L新生牛血清的DMEM培养液调成5×107/L细胞悬液，按100μL/孔接种于96孔板，24h后吸除培养液，分为空白对照组（无血清DMEM培养液）和6个处理组：分别为不同浓度的TGF-β2（0.5，1，2，4，5，10μg/L），诱导培养24h，每组设8个复孔。24h后加入MTT 20μL/孔，继续在CO2培养箱中培养4h后，弃去培养液，加入DMSO 150μL/孔，静置30min，在酶联免疫测定仪上测其在570/630nm处的吸光度值（A）。实验重复3次。另将细胞悬液1×108/L密度接种于放有盖玻片的6孔板中,贴壁24h后选用3个TGF-β2浓度组（T1 2μg/L，T2 4μg/L ，T3 5μg/L）及正常对照组（N组）（每组4片）分别加入各自不同的培养液共3mL，诱导24h后终止培养，用4℃ PBS漂洗3次，再放入4℃固定液（冷丙酮：无水乙醇＝1∶1的混合液）中固定15min，晾干后再按S-P法即用型试剂盒和DAB试剂盒说明书操作，鼠抗人Fn多克隆抗体稀释度1∶100，DAB显色2min，苏木素复染。PBS代替一抗作阴性对照。将每张片图像摄入计算机，通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统，得出代表每张爬片阳性表达强弱的平均灰密度值（A），然后再进行统计学处理。实验重复3次。另收集各组（实验分组同上：T1，T2，T3，N共4组）培养瓶中的HTF，用Trizol Reagent裂解细胞，提取总RNA，于波长260，280nm处测定吸光度（A）值。逆转录反应条件为42℃ 1h，99℃ 5min，5℃ 5min，同时设无RNA的阴性对照。PCR反应引物设计应用Primer Premier 5.0软件，其内参照为β-actin。预期CTGF的扩增片断长度为292bp，上游引物为5′-TCTTCGGTGGTACGGTGTA -3′,下游引物为5′-ACCAGGCAGTTGGCTCTAA-3′;β-actin扩增片段长度为283bp,上游引物为5′-CTGTGGCATCCACGAAACT -3′,下游引物为5′- GGACTCGTCATACTCCTGCTT -3′。反应条件为: 95℃预变性3min，95℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸40s，共循环35次，72℃最后延伸7min。RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳产物进行灰密度扫描，计算mRNA指数(mRNAindex, RI)。RI=CTGFmRNART-PCR产物扫描值β÷-actinmRNA RT-PCR产物扫描值,用以代表细胞中CTGF mRNA的相对含量。重复3次独立的RT - PCR全过程。

    统计学处理：检测结果数据均以均数±标准差(           )表示，统计采用SPSS12.0统计软件包，进行单因素方差分析，多重比较采用LSD检验法，P <0.05为差异有显著意义，P <0.01为差异有极显著意义。

    2结果

    人Tenon囊组织块贴壁法培养6d后即可见细胞自组织块边缘爬出，形态呈梭形或分枝状长多边形，胞体透明，逐渐融合并呈旋涡或放射状生长，生长旺盛，12d即融合并可传代，随着传代增加，分枝状形态细胞较多，甚至不加血清亦可见缓慢生长。TGF-β20.5μg/L，1μg/L浓度组的A值分别为0.212±0.018，0.233±0.021与正常对照组0.202±0.026无显著性差异，2μg/L，4μg/L，5μg/L组的A值分别为0.263±0.020，0.301±0.018，0.331±0.016，与对照组及相互之间差异有统计学意义，10μg/L组的A值为0.325±0.020与5μg/L组之间无显著性差异。Fn的阳性表达呈棕黄或棕褐色，位于细胞质内，胞核染为淡蓝色；正常对照组呈极弱阳性甚或阴性（图1A），随TGF-β2浓度的增加Fn的阳性表达呈增强趋势，图1B、1C分别为2μg/L、5μg/L的刺激组。3个处理组的A值分别为154.2±0.62，144.55±0.87，133.43±1.40与对照组162.38±3.14及各处理组间均有显著性差异。计算核酸纯度A260/280为1.8～2.0，说明RNA纯度较好；管家基因β-actin在4组细胞中的转录水平恒定,可以作为PCR产物相对定量标准；β-actin和CTGF分别在283bp及292bp位置上各出现一特异性条带,与预期扩增片断长度相符(图2，3)；CTGF-RI值依次为：1.062±0.013，0.988±0.011,0.938±0.010，0.878±0.008；各处理组均与正常对照组具有显著性差异,而且各处理组之间均具有显著性差异。

    图1 A：正常对照组细胞；B：2μg/L TGF-β2刺激后细胞分泌Fn明显增多，位于胞质内，染棕黄或棕褐色；C：5μg/L TGF-β2刺激组

    图2 各组的内参水平

    图3 TGF-β2对HTF CTGFmRNA的影响

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