作者：王哲文 施小茹 周世平 作者单位：吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021
【摘要】目的 观察老年白内障（≥60岁）晶状体上皮细胞培养与表皮生长因子受体（EGFR）表达。方法 用消化分离法及组织块贴片法培养老年白内障、先天性白内障、胎儿晶状体及正常成人晶状体上皮细胞；应用免疫组织化学方法检测老年白内障晶状体上皮细胞、正常成人的晶状体上皮细胞及培养的晶状体上皮细胞EGFR蛋白表达，RTPCR方法检测EGFR mRNA表达。结果 老年白内障晶状体上皮细胞传代培养基本不能增殖，先天性白内障、胎儿可传6～7代，成人晶状体上皮细胞可传4～5代；老年白内障、培养的晶状体上皮细胞及正常成人晶状体上皮细胞EGFR mRNA及蛋白均呈阳性表达。结论 晶状体上皮细胞的培养对年龄有较高的敏感性，年龄愈大，细胞越易老化，老年白内障晶状体上皮细胞传代培养基本不能增殖；人眼的晶状体上皮细胞EGFR呈阳性表达。
【关键词】 老年白内障；人晶状体上皮细胞；EGFR
晶状体上皮细胞是研究晶状体疾病最好的靶细胞,表皮生长因子受体（EGFR）在人晶状体上皮细胞表达方面的研究目前国内尚未见报道。国外研究多局限于细胞学、免疫组织化学、原位杂交等方法。笔者用RTPCR及免疫组织化学方法检测人晶体上皮细胞EGFR的mRNA及蛋白质表达，为在基因水平探索表皮生长因子（EGF）在晶状体上皮细胞增殖中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 对象
取自2004～2006年在吉林大学第一医院接受白内障手术＞60岁的老年白内障、先天性白内障患者于白内障手术中撕下的前囊膜（约5 mm直径），引产死亡时间不超过5 h的胎儿晶状体，正常成人晶状体为角膜移植术的供眼之晶状体，亦同样取前囊膜（约5 mm直径）。
1.2 主要试剂
Trizol试剂盒购自Promega公司，RTPCR试剂盒购自Takara公司，鼠抗人EGFR单克隆抗体购自Sigma公司，SP超敏组化试剂盒为迈新生物技术公司产品。
1.3 细胞培养
用消化分离法及组织块贴片法培养各组晶状体上皮细胞。
1.4 免疫组织化学方法检测晶状体上皮细胞EGFR蛋白表达
取老年白内障及正常成人晶状体前囊膜，常规石蜡包埋，每张切片厚3 μm。采用免疫组织化学法检测EGFR蛋白表达，具体按试剂盒操作说明书操作。每次染色均设用PBS代替一抗为阴性对照。培养的晶状体上皮细胞通过细胞爬片进行免疫组织化学法检测。
1.5 RTPCR方法检测EGFR mRNA表达
收集培养的晶状体上皮细胞，取约5 mm直径的前囊膜，提取总RNA。逆转录采用50 μl反应体系按照CDNA试剂盒说明进行。PCR扩增：上游引物为；5′gaagtcctgctggtagtcag3′，下游引物：5′ggatgaagaagacatggacga3′，以G3PDH为内参照。 扩增条件为95℃预变性1 min 30 s,94℃变性30 s,55℃退火30 s ，72℃延伸1 min。30个循环后，于72℃延伸10 min。
2 结 果
2.1 晶状体上皮细胞培养
无论用消化分离法及组织块贴片法培养老年白内障晶状体上皮细胞较难存活，培养3～5 d才有新生细胞，细胞传代培养基本不能增殖。而先天性白内障、胎儿或成人晶体上皮细胞，培养24 h左右可见部分上皮细胞贴壁，48 h后可见增生；3～5 d后细胞增殖较快，胎儿的晶体上皮细胞尤为明显。细胞融合长满瓶底，胎儿、先天性白内障约需10～12 d。成人约需12～14 d。传代细胞、胎儿晶体上皮细胞生长迅速，约5～7 d细胞达到融合，可传6～7代；而成人晶体上皮细胞生长缓慢，约7～14 d才达到融合。传代至第4～5代后可见细胞形态有梭形样改变，胞内有空泡，网状结构样改变。
[1] [2] 下一页 |
