【摘要】 目的 对一中国常染色体显性先天性白内障家系进行缝隙连接蛋白基因的突变筛查。 方法 通过聚合酶链反应对此先天性白内障家系中全部患者的GJA8基因、GJA3基因外显子以及邻近的内含子进行扩增，然后将扩增产物直接测序。 结果 在该粉尘状白内障家系GJA8基因和GJA3基因的外显子及其邻近的内含子中，均未发现任何突变。 结论 初步排除该先天性粉尘状白内障家系的致病基因与缝隙连接蛋白基因突变相关。
【关键词】 先天性白内障; 突变; GJA8基因; GJA3基因
Screening mutatinn of gap junction protein gene(gja8,gja3)in Chinese family with autosomal dominant congenital cataractLiao Rongfeng, Hu Jiyuan, Yang Sheng, et alept of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022[Abstract] Objective To screen mutations of gap junction protein gene in a Chinese family with autosomal dominant congenital pulverulent cataract. Methods The complete coding region and intron spliced sites of GJA8 gene and GJA3 gene were amplified with polyerase chain reaction (PCR),then we sequenced the products of PCR. Results No mutations were found in GJA8 gene and GJA3 gene in all patients of this pulverulent cataract family. Conclusion The association of gap junction protein gene with this autosomal dominant congenital pulverulent cataract was preliminary excluded.
[Key words] Congenital cataract; Mutation; GJA8 gene; GJA3 gene
先天性白内障是婴幼儿重要的致盲性眼病，此病的发生是由于胚胎期晶状体代谢异常而导致自身透明性下降的晶状体疾病，它的发病率在新生儿中为2.2/10000~2.49/10000[1]，占儿童致盲性眼病的第二位。遗传性白内障约占先天性白内障的1/3，按遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和伴性连锁遗传，而这当中常染色体显性遗传(autosomal dominant congenital cataract, ADCC)是最常见的。在遗传性白内障中，它既可以是一个独立的眼部表现，也可同其它系统异常一起构成综合征。我们在此研究的是一个不伴综合征的常染色体显性先天性粉尘状白内障家系。
1 资料与方法
1.1 研究对象 我们在皖发现一个具有显性遗传性特点的先天性白内障家系，共30人，其中患者14例。本研究遵循赫尔辛基宣言,在征得此家系所有成员的同意后，对他们进行体格检查，排除其他全身性疾病，行视力检查并详细记录，美多丽散瞳后进行裂隙灯和眼底镜检查，对患者的混浊晶体进行数码图像采集和处理。
1.2 实验方法
1.2.1 样品DNA的提取 取该家系成员外周血8~10 ml，送往安徽医科大学生物研究所实验室，用高盐沉淀法提取血液中的DNA。紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的纯度和浓度后于-20℃保存备用。
1.2.2 GJA8、GJA3基因的突变筛查 ①采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增GJA8基因和GJA3基因的目标片段：根据GJA8基因的序列设计7对引物(表1)，根据GJA3基因的序列设计6对引物(表2)。PCR反应的总体系为：10×buffer 1 μl，dNTP 1 μl(1.25 mmol/L)，上下游的引物各为0.3 μl (10 mmol/L)，模板1 μl(50 ng/μl)，taq酶0.2 μl，Mg2+0.6 μl (1.5 mmol/L)，加消毒双蒸水至10 μl。PCR反应采用Touch-Down程序，共两相循环：94℃ 5 min，第一相循环94℃ 40 s，起始退火温度64℃ 40 s，以后每个循环降0.5℃，72℃ 40 s，共14个循环;第二相循环94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 40 s，共30个循环，最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶上恒压100 V电泳30 min。在紫外透射仪下观察到目的基因片段，若扩增出目的基因片段的量很好，且无杂带和引物二聚体出现，则可进行下面的实验步骤。 ②PCR产物的纯化(以后均在冰上操作)，反应体系为：ExonⅠ0.2 μl(20U/μl)，SAP 0.4 μl(1U/μl)，消毒双蒸水1.4 μl以及PCR产物5.0 μl。其反应条件为：37℃ 60 min，85℃ 15 min。 ③测序前PCR，其反应体系为：PCR产物1.0 μl，单条引物1.0 μl (5 pmol/μl)，DTCS 1.0 μl以及消毒双蒸水3.0 μl。反应条件为：96℃ 20 s，50℃ 20 s，60℃ 4 min，共30个循环。④纯化试剂的配制(即配即用原则)，每份含EDTA 1.0 μl，NaAC 1.0 μl，Glycogen 0.5 μl。⑤将纯化试剂2.5 μl，测序前PCR产物6.0 μl和95%的冰乙醇30.0 μl在反应管中混匀后，14000 r/min，15 min离心。@倒去每管的上清，加70%的冰乙醇100 μl，12000 r/min，5 min离心。重复@步骤两次，倒去上清，短暂离心后，用10 μl的枪吸出残留液，在37℃避光干燥箱中干燥20 min，再在每管中加入30 μl SLS，反复吹打DNA沉淀后，5000 r/min，20 s离心，然后上样测序。测序在安徽医科大学省部共建重点遗传实验室进行，仪器为ceq8800测序仪。
PCR产物5.0 μl。其反应条件为：37℃ 60 min，85℃ 15 min。③测序前PCR，其反应体系为：PCR产物1.0 μl，
表1 GJA8基因外显子的7对引物
表2 GJA3基因外显子的6对引物
单条引物1.0 μl (5 pmol/μl)，DTCS 1.0 μl以及消毒双蒸水3.0 μl。反应条件为：96℃ 20 s，50℃ 20 s，60℃ 4 min，共30个循环。④纯化试剂的配制(即配即用原则)，每份含EDTA 1.0 μl，NaAC 1.0 μl，Glycogen 0.5 μl。⑤将纯化试剂2.5 μl，测序前PCR产物6.0 μl和95%的冰乙醇30.0 μl在反应管中混匀后，14000 r/min，15 min离心。@倒去每管的上清，加70%的冰乙醇100 μl，12000 r/min，5 min离心。重复@步骤两次，倒去上清，短暂离心后，用10 μl的枪吸出残留液，在37℃避光干燥箱中干燥20 min，再在每管中加入30 μl SLS，反复吹打DNA沉淀后，5000 r/min，20 s离心，然后上样测序。测序在安徽医科大学省部共建重点遗传实验室进行，仪器为ceq8800测序仪。
2 结果
2.1 家系特点 经系谱调查和全面的眼科检查，发现该家系共有30个家系成员，14个为患者，其遗传方式符合常染色体显性遗传特点(图1)。采集到血样者有14
人，患者9人，男5人，女4人。患者视力从指数至0.6不等。该家系发病特点是双眼患病，表现为粉尘状混浊(图2)，但不同的眼别之间晶状体混浊的程度不一，而且不同患者之间晶状体混浊的程度和形态也不一致。部分患者由于晶状体混浊程度轻，对视力影响较小，在对其进行裂隙灯检查时才发现他们患有粉尘状白内障。
图1 常染色体显性遗传性粉尘状白内障的家系图
图2a 此家系一患者眼前部照相图 图2b 同一患者的裂隙灯检查照相
图2 常染色体显性遗传性粉尘状白内障患者眼前部照相
2.2 实验结果 通过直接测序，在该家系的所有患者中，未能发现GJA8和GJA3基因的外显子以及外显子与内含子相邻的部位有任何碱基的改变，从而排除了该家系患者的先天性白内障是由缝隙连接蛋白基因突变所致病。
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