【摘要】 羊膜移植现已被广泛应用于治疗眼表疾病，如翼状胬肉、化学伤、睑球粘连以及角膜溃疡(包括感染性角膜溃疡和神经营养不良性角膜溃疡)等, 并已被证实羊膜移植用于翼状胬肉手术能减少翼状胬肉复发。用于化学伤和角膜溃疡，可促进角膜上皮增生和修复以及抑制新生血管形成。用于治疗睑球粘连,可减少瘢痕形成以重建眼表。本文就羊膜移植治疗眼表疾病的机理进行综述。

　　【关键词】 羊膜移植;眼表疾病;进展

　　羊膜移植最早由Davis1910年报道用于治疗烧伤的皮肤。1940年De Roth首先使用带有绒毛膜的羊膜治疗结膜缺损6例，结果5例羊膜发生了进行性萎缩、自溶而失败。后来未见更多的相关报道。在1995年Kim和Tseng改进取材方法和保存方法后才获得成功。1997年Lee等报道在临床上应用保存的人羊膜移植术可有效地治疗角膜溃疡。人羊膜移植渐渐推广应用于眼科临床,尤其是应用于治疗眼表疾病，已成为治疗眼表疾病重要而有效的方法之一。但其治疗眼表疾病的机理目前仍不十分清楚,现就以下几个方面对人羊膜移植治疗眼表疾病的机理进行综述。

　　1 低抗原性

　　人羊膜无血管和淋巴管, 故相对于带有血管和淋巴管的组织来说其抗原性低。1981年,Akle CA、Adinofli M及Welsh KI等将羊膜移植于皮肤下,6周内未见炎性细胞浸润、肉芽组织增生及新生血管形成。1982年，Adinofli M及Akle CA等用免疫荧光染色技术在新鲜及试管内培养的人羊膜上皮细胞内均未发现HLA-A、B、C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表达, 而用更敏感的放射生物技术检测, 才发现微量HLA-A、B、C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表达。后来的研究发现人羊膜上皮细胞表达I型HLA抗原和含有I型HLA的mRNA。Houlihan JM等研究发现人羊膜上皮细胞表达HLA-E和HLA-G。而Hammer A等[1]研究发现羊膜上皮表达经典HLA- I和HLA-G。Kubo M等[2]也发现在冷藏的羊膜中的上皮细胞、间充质细胞、纤维母细胞均表达I型HLA抗原，一些纤维母细胞出乎意料地表达II类HLA抗原。羊膜移植到角膜缘处，虽然有一些CD4+和CD8+ T细胞围绕羊膜移植物，但其反应是温和的。而移植到角膜内，所有的羊膜移植物均未被排斥且保持透明，也无宿主细胞浸入。相反所有移植到角膜内的皮肤移植物均在3周内被排斥。这些研究虽未证实人羊膜无抗原性,但表明其抗原性低。所以在同种异基因移植中不易引起排斥反应[3]。

　　2 良好的基底膜替代物

　　在移植手术中羊膜可作为一个载体起着生物支架作用，即起着基底膜的作用。羊膜的基底膜中含有IV型胶原、整合素、板层体等成分, 这些成分在上皮细胞向基底膜的附着及上皮细胞的移行、增殖和分化中都起着重要的作用[4]。羊膜、结膜和角膜的基底膜中层黏连蛋白-1、层黏连蛋白-5、纤维连接蛋白和Ⅶ型胶原的分布是相同的。且羊膜基底膜中的 IV型胶原的α亚链的分布与结膜中的分布相同，只与角膜基底膜中的分布不相同。所以羊膜同结膜可能有共同的基底膜成分, 故其可作为结膜基底膜的替代物[5]。在羊膜上培养的兔结膜上皮细胞主要呈现一个非杯状细胞结膜上皮的表型[6],但其不能诱导结膜上皮细胞转分化成角膜上皮细胞[7]。由于羊膜在巩膜上形成了连续性胶原薄垫片, 其可能具有抑制结膜下纤维化的机械屏障的功能，通过羊膜移植, 为病变组织提供了健康的上皮下基质环境, 可以促进正常结膜上皮化, 防止广泛性结膜下纤维化瘢痕形成[8]。在翼状胬肉及睑球粘连等手术中,羊膜覆盖在裸露的巩膜表面，有利于结膜上皮的生长、移行，从而有利于眼表重建。同时羊膜具有极强的抗结膜间粘附效果也有助于防止睑球粘连,有利于穹隆部结膜囊的成形[9]。

　　3 促进上皮增殖、分化和生长

　　羊膜中含有许多促进上皮增殖、分化和生长的细胞因子。在保存的人羊膜中，逆转录PCR显示人羊膜中含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、角质细胞生长因子( KGF)、肝细胞生长因子( HGF)、转化生长因子α(TGF-α) 、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、转化生长因子β3(TGF-β3)以及KGF受体(KGFR)和HGF受体(HGFR)的mRNA, 而ELISAS结果显示人羊膜中含有EGF、 bFGF、KGF、HGF、TGF-α、TGF-β1和TGF-β2等七种细胞因子[10]。这些细胞因子，特别是EGF、bFGF、KGF和HGF在羊膜移植治疗眼表创伤中起着重要的作用。

　　3.1 EGF 是Cohen1962年报道的从小鼠颌下腺提取到一种热稳定蛋白, 它可以对眼睑和门齿的发育产生刺激作用[11]，对表皮生长具有直接作用, 对多种组织来源的上皮细胞亦有很强的促分裂活性,还能刺激各种间质细胞增殖。EGF通过与其受体(EGFR)结合后被活化并传导细胞内信号发挥生物学作用。人角膜广泛表达EGFR[12]，Savage首先证明了EGF可以刺激角膜上皮增生, 在伤口愈合中能刺激角膜上皮细胞增殖、趋化和移行。

　　3.2 bFGF 是一种具有很强的促进细胞生长作用的因子，能在极低浓度下起作用，具有广泛的生物学效应。其参与网状内皮组织及结缔组织的修复，对神经系统亦有营养作用，在胚胎发育中具有促进细胞增殖和分化的功能，还参与内分泌及生殖功能的调节。此外, FGF能促进角膜上皮细胞和角膜细胞分裂、趋化、移行和伤口愈合。人和动物眼中存在着的FGF主要由bFGF起作用,它的作用比aFGF强10～100倍。FGF存在两类受体(FGFR)：一种是高亲和力受体，一种是低亲和力受体。FGFR也分布于人角膜组织中。

　　3.3 KGF 由Rubin等分离提纯的26至28KD的单链多肽, 并被证实有促进上皮细胞的增殖与分化，维持细胞骨架的稳定等作用。Sotozono等的实验表明，KGF明显地促进了兔角膜上皮细胞的分裂、增殖。KGF可以促进角膜上皮细胞与内皮细胞的分裂、增殖, 但不能促进成纤维细胞的增殖，其受体大多分布在角膜上皮细胞。

　　3.4 HGF 可作用于多种组织细胞,具有促进细胞有丝分裂、运动以及组织器官的形态发生等作用。 对于角膜上皮细胞而言，HGF同样具有促进其增殖、运动、分化等作用。HGF生物活性的发挥是通过与其受体结合, 经过信号转导实现的, 其在角膜上皮细胞转导途径为HGF激活Ra MAPK(mitogen-activated protein kinase)途径[13]。角膜内皮细胞和纤维细胞可产生HGF并表达HGFR, 角膜上皮细胞仅表达HGFR，而角膜成纤维细胞分泌的HGF可通过旁分泌途径作用于角膜上皮细胞。HGF不仅在角膜生理平衡方面发挥作用, 而且在角膜的损伤修复过程中起着同样重要的作用。

　　带有上皮的羊膜比不带有上皮的羊膜具有更高水平的EGF、KGF、HGF和bFGF的含量，提示这些生长因子为上皮来源[10]。因此，在羊膜取材过程中保持其上皮的完整性及保存过程中尽量维持其上皮的活性。此外，羊膜作为培养基能扩大角膜上皮神经生长因子信号的作用，在严重的神经性角膜溃疡中，羊膜移植能促进角膜上皮快速形成[14]。

　　4 含有促进角膜上皮细胞黏附的小分子物质

　　人羊膜含有层黏连蛋白-5,其α3链以190-kDa和160-kDa的形式存在、其β3链以145-kDa的形式存在、其γ2链主要以105-kDa的形式存在，极少以155-kDa的形式存在。相似的层黏连蛋白-5的分布亦存在角膜上皮细胞中，层粘连蛋白-5 α3链和γ2链能增强角膜上皮细胞黏附力，其黏附功能的调节可能与羊膜下的角膜上皮细胞分泌的细胞因子有关[15]。

　　5 参与细胞外基质(ECM)、基质金属蛋白酶(MMPs)/

　　金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-s)、细胞因子、细胞间复杂的网络调节控制机制，以适应眼表组织重塑和创伤修复对ECM动态平衡的需要，同时抑制瘢痕形成

　　5.1 MMPs 是一组参与ECM降解的蛋白酶 不同种属或细胞间同种MMPs的生物学特性变异非常小，几乎能降解除蛋白多糖以外的全部的ECM成分，其主要作用为降解基质蛋白, 按其作用底物的不同而被分为四大类: 胶原酶、明胶酶、基质溶素及膜型MMPs。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)显示人羊膜上皮细胞和间充质细胞都表达四种TIMPs[16]，TIMPs是近年发现的一组抑制MMPs活性的糖蛋白，细胞外基质中TIMPs是MMPs活性最重要的特异性抑制因子, 现已发现4种TIMPs, 分别命名为TIMP 1、TIMP 2、TIMP 3及TIMP 4, 且具有器官特异性[17]。TIMPs分为两个功能区，其N端功能区的半胱氨酸残基与MMPs的锌离子活性中心结合, 其C端功能区与MMPs的其他部位结合, 以1∶1的比例形成复合体, 从而阻断MMPs与底物结合，抑制酶的活性。TIMP不仅能与酶的催化位点结合, 使酶失活, 还能与酶原的某些位点结合,阻止酶原的活化[18]。近来发现，TIMPs除能抑制MMPs活性外,还具有其他生理功能,如TIMP 2抑制细胞增殖, TIMP 3诱导细胞凋亡[19]。MMPs/TIMPs的表达受多种细胞因子的调节，多数生长因子都可促进MMPs基因的表达与合成, 如EGF、bFGF、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)和血小板源性生长因子(PDGF)等。如: IL-1、TNF-2、ECF、TGF-α、FGF等可上调MMP-1、MMP-3的表达;而TGF-β、γ-干扰素(IFN-γ)及IL-4则可下调其表达。但TGF-β可促进MMP-2和TIMP的表达, 这种不同的调节作用可能有利于组织的重塑和创伤的修复。

　　5.2 抑制TGF-β信号系统的表达 哺乳动物中的TGF-β有3种不同的同分异构体, 即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,它们分别由不同的基因编码, 这些TGF-β的成熟的多肽片段具有很高的结构同一性, 同时也具有相似的生物学作用。TGF-β1、TGF-β2被人类眼前段所表达, 它们的生物学作用是通过与其受体结合而发挥。在伤口愈合过程中, 基质成纤维细胞通常被活化，该活化过程包括细胞内收缩装置的表达。这些收缩装置主要由α 平滑肌肌动蛋白(α-SM)、α-辅肌动蛋白、肌球蛋白等组成的细胞内F-肌动蛋白微丝束。其中，α -SM水平的高低代表成纤维细胞活化的程度，而Tseng等[20]证实了TGF-β是重要的α-SM上调因子。此外TGF-β可以促进细胞外基质如: 胶原、蛋白聚糖及纤维连接蛋白等的合成与沉积和促进蛋白酶抑制剂及细胞粘附受体的合成，以及减少蛋白酶的合成，这些作用虽然加速了伤口愈合,但也促使了瘢痕形成。而TGF-β1在减少蛋白酶的合成和促进蛋白酶抑制剂的合成中起着主要作用, 羊膜移植治疗兔角膜重度碱烧伤, 早期可降低基质TGF-β1mRNA的表达, 起到部分减轻基质混浊的作用[21]。羊膜能抑制TGF-β信号系统、DNA的合成及随后的肌成纤维细胞分化，在保存羊膜上培养的角膜及角膜缘纤维母细胞早在接触羊膜8h开始，它们的TGF-β1、β2、β3和TGF-βⅡ型受体转录子以及TGF-β1、β2蛋白均被抑制，这种抑制在羊膜移植24h后更为显著[20]。羊膜表层也能抑制正常结膜的纤维母细胞和翼状胬肉纤维母细胞中的TGF-β信号系统，它能显著地抑制正常结膜的纤维母细胞和翼状胬肉纤维母细胞中的TGF-β2、β3和所有三型TGF-β受体转录子的表达，以及α-SM、β1-整合素转录子和CD44转录子的表达均被显著地抑制[22]。羊膜移植用于眼表重建能抗瘢痕形成，也能部分解释为什么胎儿的伤口愈合是无瘢痕[20]。

　　6 羊膜中含有抑制新生血管因子和抗炎蛋白

　　免疫组织化学研究证实新鲜制备的人羊膜上皮细胞、间充质细胞及羊膜基质致密层都含有TIMP家族所有成员。这些物质在羊膜移植中起着抑制新生血管因子和抗炎效应[16]。在羊膜上培养的角膜缘上皮细胞其IL-α1和IL-β1的转录子和蛋白的表达显著性地减少，羊膜可显著性抑制脂多糖所诱导IL-α1和 IL-β1的上调作用，这可以部分解释羊膜移植能减少眼表疾病的炎症[23]。角膜碱烧伤后可引起大量多形核白细胞浸润, 其在吞噬坏死组织过程中, 释放大量活性物。角膜碱烧伤后早期实施羊膜移植术能有效抑制自由基的生成及增强SOD的活力, 新鲜羊膜较保存羊膜含有更多的活性成分, 因而能更有效地减少自由基对组织的损伤[24]。

　　7 羊膜能抑制角膜细胞凋亡

　　在角膜创伤的早期愈合阶段，羊膜能抑制角膜细胞凋亡，从而减轻创伤后角膜的混浊[25]。此外羊膜能抑制角膜上皮细胞凋亡，有利于眼表疾病角膜上皮的修复。

　　8 抗感染作用

　　羊膜覆盖在眼表创面可起着屏障作用，同时羊膜具有强大的粘附能力可阻止微生物的移行。Talmi等认为羊膜强大的粘附能力和移植后与植床的紧密接触(通过弹力蛋白-纤维连接)是羊膜具有抗微生物特性的主要原因, 通过紧密接触, 宿主自身的防御机制得以发挥作用, 从而降低术后感染的发生率。

　　总之，羊膜移植治疗眼表疾病的机制是非常复杂的，既含有促进血管形成的生物活性物质，又含有抑制血管形成的生物活性物质;既含有TGF-β1、β2和β3，又能抑制眼表TGF-β1、β2和β3的形成及活性;既含有利于细胞外基质合成的活性物质，又能抑制细胞外基质的合成与沉积。羊膜自身和所含有的生物活性物质形成的这一个复杂的生物学作用，既有利于眼表重建，又能抑制新生血管和瘢痕形成。

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