体外培养人眼小梁细胞吞噬乳胶微粒的研究

中华眼科杂志 1999年第5期第35卷 论著摘要

作者：王　强　魏厚仁

单位：（王　强）　256603 山东省滨州医学院附属医院眼科；（魏厚仁）　同济医科大学附属协和医院眼科

　　原发性开角型青光眼及某些继发性开角型青光眼的病理改变与覆盖在小梁柱表面的小梁细胞功能改变有关［1］；小梁细胞具有增殖、移行、吞噬及合成分泌细胞外基质、激素或酶的功能。其中小梁细胞的吞噬功能在清除异物、保持房水滤道通畅方面具有重要作用［2，3］。我们采用体外培养的人眼小梁细胞，观察其吞噬乳胶微粒的过程。

　　一、 资料和方法

　　1.小梁细胞原代和传代培养：取各种原因死亡8 h的新生儿眼球，按王林等［4］报道的方法进行组织块培养。无菌显微镜下操作，取出小梁组织，剪成1 mm×2 mm组织块，置入培养瓶内，待贴壁后加入含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37℃恒温CO2培养箱内，5％CO2内加95％湿润空气。每周换液2次，待细胞生长到一定程度或传代细胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。

　　2.细胞吞噬实验：第3代细胞悬液接种在培养瓶内，按上述条件培养，1周后细胞融合铺满瓶底。瓶内加入105个乳胶微粒，直径0.825 μm，倒置显微镜下间断观察96 h。

　　3.超微结构观察：加入微粒后18h的细胞做电镜标本。（1）透射电镜：胰酶消化细胞，细胞悬液离心，加入0.5％戊二醛液固定2h，PBS液洗3遍，经乙醇梯度脱水，1％锇酸固定，做成超薄切片，透射电镜下观察。（2）扫描电镜：取铺满细胞的盖玻片，2.5％戊二醛液固定，PBS液清洗，乙醇梯度脱水，临界干燥，镀金后扫描电镜下观察。

　　二、结果

　　1.细胞生长观察：接种组织块4天后可见小梁细胞开始从组织块移行生长，数天可增殖形成以组织块为中心内密外疏的细胞团。细胞的形态学特征符合国内外报道及作者以往报道［4-6］，可证实作者培养的细胞为人眼小梁细胞。

　　2.倒置显微镜下见大量乳胶微粒漂浮于营养液内，从4 h始，细胞浆内可见到少量微粒，随着时间延长细胞浆内微粒增多；至24 h，吞噬微粒的细胞收缩变形，融合细胞之间出现裂隙；36 h分散成单个细胞；48 h细胞收缩成圆形；至96 h细胞死亡浮起。

　　3.扫描电镜下可见胞膜内陷、吞噬、包裹微粒的过程，透射电镜下可见细胞表面微绒毛与微球接触，胞膜内陷形成吞噬小体，从细胞表面至核附近均可见吞噬小体，1个吞噬小体内一般有1个微球。细胞吞噬微球后呈“激惹”征，细胞内糖原颗粒增多，核异染色质减少，细胞器丰富。

　　三、讨论

　　1.小梁细胞的吞噬功能在青光眼发病中的作用：某些继发性青光眼，如前房积血、剥脱综合征、色素性青光眼等病理过程中必有小梁细胞对异物的吞噬过程，以清除房水循环中的碎片，疏通滤道。Bill［7］认为小梁细胞吞噬功能受损可能是慢性单纯性青光眼的病因。体内的小梁细胞具有多种功能，诸如增殖、移行、收缩、吞噬、分泌细胞外基质等，任何一种功能异常均可导致房水滤道流出易度下降［1-3］。Rohen和Lutjen-Drecoll［1］发现，当体内小梁细胞受到损伤，如外伤、过度异物接触，呈现“激惹”状态时，其特征是核异染色质缺少，粗面内质网丰富，高尔基器发达；并认为这种细胞是房水流出系统的修复细胞。尚未见文献报道此种细胞在各种青光眼发病中的作用，但这种细胞具有极强的吞噬异物的能力。

　　2.吞噬后小梁细胞的转归：在动物实验［8］及牛眼小梁细胞体外培养实验中［9］，可见吞噬异物后的小梁细胞变圆，小梁细胞移行与小梁柱脱离，小梁细胞数目减少。但尚未见人活体眼部小梁细胞变化的报道。国内杨新光和李美玉［10］观察了牛眼小梁细胞体外吞噬乳胶微粒的过程，发现体外培养的牛眼小梁细胞具有极强吞噬乳胶微粒的能力，肾上腺素及可的松可抑制小梁细胞吞噬功能，表皮生长因子对吞噬作用无影响。作者应用体外培养的人眼小梁细胞研究其吞噬乳胶微粒的过程，发现吞噬异物后的细胞有收缩、移行、“激惹”、变性、死亡的过程。提示在某些情况下（如前房积血、色素膜炎等），应及时清除异物，避免过度刺激小梁细胞，以减少继发性青光眼的发生。

　　参考文献

　　1　Rohen JW, Lutjen-Drecoll E. Biology of the trabecular meshwork. In:Lutjen-Drecoll E,ed. Basic aspects of glaucoma research. New York:schattaccer- stuttgart,1986.141-166.

　　2　王　强,魏厚仁.小梁细胞吞噬功能的研究.眼科新进展,1992,12:55-57.

　　3　Grierson I,Day J, Unger WG, et al. Phagocytosis of latex microspheres by bovine meshwork cells in culture. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1986, 224: 536-544.

　　4　王　林, 魏厚仁, 曾水清, 等. 人眼小梁细胞组织培养及超微结构观察.中华眼科杂志,1989,25:97-99.

　　5　Wang Qiang, Wei Houren, Fan Zhengjuu, et al. Effect of clonidine and norfloxacin on human trabecular meshwork cells in vitro. Graefe's Arch Exp Clin Ophthalmol, 1994,232:566-571.

　　6　Tripathi RC, Tripathi BJ. Human trabecular eudothelium,corneal endothelium, keratotytes, and scleral fibroblasts in primary culture. Exp Eye Res,1982,35:611-624.

　　7　Bill A. The drainage of aqueous humor. Invest Ophthalmol, 1975,14:1-3.

　　8　Sherwood ME, Richardson TM. Phagocytosis by trabecular meshwork cells: sequeuce of events in cats and monkeys. Exp Eye Res, 1988,46:881-895.

　　9　Day J, Grierson I, Unger WG, et al. Some effects of phagocytosis on bovine meshwork cells in culture. Exp Eye Res, 1986,43:1077-1087.

　　10　杨新光,李美玉. 牛眼小梁细胞体外培养及吞噬功能的研究. 中华眼科杂志,1996,32:136-139.