【摘要】  目的 观察叶黄素（lutein）对体外培养的牛晶状体上皮细胞（bovine lens epithelial cells，BLECs）增殖和移行的影响，为药物防治后发性白内障（after-cataract）提供新的选择。方法 首先进行BLECs原代培养和传代培养。取第2～3代BLECs，分别采用MTT法、划线法，研究不同浓度及作用时间的叶黄素对体外培养的BLECs增殖及移行的影响。结果 （1）与对照组相比，当浓度>1 umol/L时，叶黄素能够明显抑制BLECs的增殖，差异有显著性（P<0.01）。相同作用时间不同浓度组之间抑制作用比较，随药物浓度的增加，抑制作用加强，各浓度组之间差异有显著性 （P<0.01）。而相同药物浓度组随着作用时间的延长，抑制作用加强，各时间点差异亦有显著性（P<0.01）。（2）浓度为1 umol/L和2 umol/L的叶黄素能明显抑制BLECs的的移行，与对照组相比，差异有显著性（P<0.01）。两组间愈合率比较，差异亦有显著性（P<0.01）。结论 （1）在浓度≥1 umol/L时，叶黄素能有效抑制BLECs的增殖。（2）浓度为1 umol/L和2 umol/L的叶黄素能抑制BLECs的移行，其强度呈一定时间依赖性。（3）叶黄素可能成为药物治疗后发性白内障的新选择。

【关键词】  叶黄素；牛晶状体上皮细胞；后发性白内障；增殖；迁移

      后发性白内障（after-cataract）是晶状体囊外摘除术后常见的并发症。其发病率在术后3～5年，成人为15％～50％，儿童几乎为100％。其原因与残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）转化为成纤维细胞，并大量增殖移行有关。

    目前国内外对预防后发性白内障主要采取改进白内障囊外摘除术式或术中术后应用抗代谢药物或两者并用，有一定改善，但其对眼内组织毒性大且作用不具特异性，后发性白内障的发病率依然高。

    本实验通过研究叶黄素对晶状体上皮细胞的增殖及移行的影响，探讨叶黄素可能的作用机制及其对药物预防后发性白内障的意义，以期为后发性白内障的治疗提供新的思路。

    1  材料与方法

    1.1  试剂与仪器  DMEM培养基（美国Gibco公司产品），胎牛血清FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（Gibco公司），甲基噻唑基四唑（MTT）（Sigma公司），DG－3022A型酶联免疫检测仪（Sunrise），叶黄素（天津一方科技有限公司）

    1.2  实验方法

    1.2.1  BLECs的培养  取牛晶状体前囊膜，以囊膜面朝上置于培养皿中。用含0.25％胰蛋白酶的消化液消化5～10 min，加入含20％FBS的培养基中止消化。收集细胞入50 ml培养瓶中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养，静置2 d待细胞贴壁，换液。以后每隔2～3 d换液1次，待细胞长满后进行传代培养。

    1.2.2  叶黄素对BLEC增殖的影响  第2～3代BLECs长满培养瓶底并发生融合时，以胰蛋白酶（0.25％）37℃消化5 min，使细胞从瓶底脱落。加入含血清培养基中止消化。1000 r/min离心5 min，弃上清，加含10％FBS的DMEM培养液，制成细胞悬液。调整细胞密度为50000个/ml，接种至3个96孔培养板中（分别为24、48、72 h），每孔100 ul。贴壁24 h细胞培养后分别在各孔中加入10 ul不同浓度的叶黄素（终浓度分别为1、2、4、8、16 umol/L）[1]。每个浓度设四个平行样，分别于培养24、48、72 h后取出进行MTT检测。本实验设空白对照为阴性对照。

    1.2.3  MTT法测定晶状体上皮细胞增殖活性[2]  于各孔中加入10 ul 5 g/L的MTT。37℃孵育4 h后再在每孔中加入100 ul的二甲基亚砜，37℃放置10 min，使结晶充分溶解。用DG-3022A型酶联免疫检测仪测量570 nm波长的吸光度值A。

    1.2.4  划痕试验[3]  铺板的时候，在板的背面用记号笔划6道平行等距的横线，种细胞（50000个/ml）于6孔板，每孔1200 ul。在37℃、5％CO2条件下培养。待细胞80％融合时用200 ul枪头垂直于板底横线划痕，无血清培养液冲去细胞碎片（400~500 ul/次），加入含1%FBS的培养液1080 ul，加入120 ul不同浓度的叶黄素（终浓度分别为1、2、4、8、     16 umol/L）。设阴性对照。照相，测距离。位于划痕缘记号笔标记处每间隔0.3 mm标定3个测量点，测量每一个点垂直于划痕方向的宽度，计算3点的均值作为试验的初始划痕宽度值。此时作为划痕后零时。6、12、24 h后重复照相，测距离按下述公式计算该划痕不同时间点的愈合速率：

    （初始划痕宽度值-相应点划痕宽度值）/初始划痕宽度值×100%。

    1.2.5  统计学方法  实验数据采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示。A值按时间点及浓度分组，组间比较采用单因素方差分析，愈合率采用两因素（组内因素：时间点；组间因素：浓度）重复测量资料的方差分析。

    2  结果

    2.1  叶黄素对BLECs生长的影响  各组A值的检测显示：与对照组相比，当浓度≥1 umol/L时，在24、48、72 h叶黄素均能够明显抑制BLECs的增殖，差异有显著性（P<0.01）。在同一作用时间内不同浓度组之间，随着浓度的增加，吸光度值逐渐降低，各浓度组之间吸光度值的比较差异有高度显著性（P<0.01）。而同一药物浓度组随着作用时间的延长， 吸光度值亦逐渐降低，差异亦有显著性（P<0.01）。见表1。

    2.2  叶黄素对BLEC移行的影响  不同浓度的叶黄素作用6、12、24 h后，BLECs的移行愈合率见表2。结果显示：与空白对照组相比，浓度为1 umol/L和2 umol/L的叶黄素能抑制BLECs的移行，在  24 h该时间点时抑制效果显著，彼此间愈合率差异明显（分别P=0.004及P=0.001），有统计学意义（P<0.01）。对照组与其他3个浓度组之间的愈合率比较抑制效果不明显，差异无显著性。表2显示了不同浓度的叶黄素作用6、12、24 h后，细胞移行愈合率的变化，数据显示，由于细胞受到划痕损伤，在6 h这个时间点所有细胞组愈合率均为负值（细胞受损后坏死崩解溶酶体释放损伤周围细胞），但随时间延长，空白组愈合率逐步增加，符合伤口愈合反应。而1 umol/L组及2 umol/L组从图1可以看出，随着时间的延长，划痕伤口进一步扩大，说明叶黄素对晶状体上皮细胞移行有抑制作用，且在一定的浓度范围内随着浓度的增加，对细胞移行的抑制作用增强。

    3  讨论

    晶状体后囊为胚胎上皮细胞的产物，出生后，后囊下已无上皮细胞。正常情况下， 晶状体上皮细胞不会在后囊出现，任何沉积在后囊中央的上皮细胞或其残片，均意味着一种病理改变。研究证明，后囊膜由多种细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成，包括I，Ⅱ，IV型胶原，纤维连接蛋白（fibronectin）和层黏连蛋白（laminin）等。可以说后囊膜具备细胞生长的条件，但是晶状体上皮细胞为什么在正常情况下不向后囊生长及移行，而在晶体囊外摘出术后，残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）才转化为成纤维细胞，向后囊膜大量增殖移行从而产生后发性白内障呢？这一方面可能与创伤及生长环境改变有关，另一方面是否与失去了抑制因素有关呢?正常情况下位于晶状体上皮细胞及晶状体皮质中的叶黄素因此进入了我们的视线。

    叶黄素又名“植物黄体素”，是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果中的天然脂溶性类胡萝卜素（3，3－二羟基 －d－胡萝卜素），人体不能合成，所需只能从富含叶黄素的食物或补品中摄取。摄取的叶黄素在人晶状体中主要位于晶状体皮质和上皮组织中。

    正常情况下叶黄素的分布与晶状体细胞一致[4]，白内障手术去除了大部分的前囊膜、全部的皮质及核，打破了这种一致，使晶状体失去了叶黄素可能的保护作用[5]，同时增加了各种损伤因素因而发生了后发障。

    流行病学研究表明，叶黄素通过减少光敏物质，与单态氧、自由基及活性氧物质反应，延缓膜磷脂的过氧化反应，并吸收蓝光，减少自由基的形成，达到其抗氧化的作用[4]。

    此外除了抗氧化作用外，大量国外实验室研究[6-13]证明叶黄素能影响多种细胞（包括肿瘤细胞）的增殖、分化。2003年Chew等[6]报道叶黄素能通过选择性调节凋亡及血管发生而抑制小鼠乳腺癌的生长，Gross等[7]也发现叶黄素能诱导HL－60细胞的分化（呈剂量依赖性）。Lee等[8]发现在人内皮细胞中叶黄素通过增强AKT的磷酸化而降低特异性AKT抑制因子从而抑制组织因子活性。Selvaraj等[9]报道，通过PPAR-γ/RXR途径（过氧化物酶体增生物激活受体γ/维甲酸X受体途径），叶黄素与EPA（二十碳五烯酸）相互作用能改变鸡巨噬细胞及HD11细胞株中NOS mRNA水平。Jin等[10]发现叶黄素通过抑制NF-?资B依赖的信号传导途径，减少前炎症介质（NO，TNF-α，IL-6，MCP-1，MIP-2 PEF2）的产量而抑制内毒素诱导的葡萄膜炎。

    而叶黄素对晶状体上皮细胞的增殖及移行是否有抑制作用，目前国内外少见报道。本研究结果表明，当浓度≥1 umol/L时，叶黄素能够明显抑制BLECs的增殖，相同作用时间随浓度增加抑制作用加强（Ｐ<0.01）。相同药物浓度随着作用时间的延长，其抑制作用亦增强（P<0.01），说明叶黄素对晶状体上皮细胞的生长抑制作用具有量效及时效关系。叶黄素对BLECs移行的影响在浓度为1 umol/L和2 umol/L且时间为24 h时明显（P<0.01），两组间愈合率比较差异亦有显著性（P<0.01），说明叶黄素对晶状体上皮细胞移行有抑制作用且在一定的浓度范围内随着浓度的增加，对细胞移行的抑制作用增强。而当浓度>2 umol/L时，抑制作用不明显可能为：?譹?訛由于本次试验的叶黄素为脂溶性粉末，高浓度时提供了更多的细胞联系所致。?譺?訛高浓度时叶黄素可能通过抗氧化或其他作用机制中和了其抑制作用。叶黄素对晶状体上皮细胞增殖及移行的抑制是否与上述一种或几种途径有关，还有待进一步研究。

    以上研究结果表明，叶黄素对晶状体上皮细胞的增殖及移行具有抑制作用，作为一种人体自身存在的天然营养物质，且无毒副作用，在对后发性白内障的药物治疗中具有极大的优势。

【参考文献】
  [1] Itagaki S， Ogura W， Sato Y， et al. Characterization of the disposition of lutein after i.v. administration to rats[J]. Biol Pharm Bull，2006，29（10）：2123-2125.

[2] 张敏，张效房，高晓东，等.　MTT比色法测定药物对晶体上皮细胞增殖的影响[J]. 眼科研究，1997，15（4）：233-235.

[3] 刘涛，金岩，王新文，等. 成纤维细胞上清提取物对成纤维细胞增殖迁移的影响[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志，2006，16（3）：129.

[4] Santosa S， Jones PJ. Oxidative stress in ocular disease：does lutein play a protective role?[J]. CMAJ，2005，173（8）：861-862.

[5] Wang E， Zhao M， Forrester JV， et al. Electric Fields and MAP Kinase Signaling Can RegulateEarly Wound Healing in Lens Epithelium[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（1）：244-249.

[6] Chew BP， Brown CM， Park JS， et al. Dietary lutein inhibits mouse mammary tumor growth by regulating angiogenesis and apoptosis[J]. Anticancer Res，2003，23（4）：3333-3339.

[7] Gross MD， Bishop TD， Belcher JD， et al. Induction of HL-60 cell differentiation by carotenoids [J]. Nutr Cancer，1997，27（2）：169-173.

[8] Lee DK， Grantham RN， Mannion JD， et al. Carotenoids enhance phosphorylation of Akt and suppress tissue factor activity in human endothelial cells[J]. Nutr Biochem，2006，17（11）：780-786.

[9] Selvaraj RK， Klasing KC. Lutein and eicosapentaenoic acid interact to modify iNOS mRNA levels through the PPARgamma/RXR pathway in chickens and HD11 cell lines[J]. Nutr， 2006，136（6）：1610-1616.

[10] Jin XH， Ohgami K， Shiratori K， et al. Inhibitory effects of lutein on endotoxin-induced uveitis in Lewis rats[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47（6）：2562-2568.

[11] Chew BP， Wong MW， Wong TS. Effects of lutein from marigold extract on immunity and growth of mammary tumors in mice[J]. Anticancer Res，1996，16（6B）：3689-3694.

[12] Chang S， Erdman JW Jr， Clinton SK， et al. Relationship between plasma carotenoids and prostate cancer[J]. Nutr Cancer， 2005，53（2）：127-134.

[13] McDevitt TM， Tchao R， Harrison EH， et al. Carotenoids normally present in serum inhibit proliferation and induce differentiation of a human monocyte/macrophage cell line（U937）[J]. Nutr，2005,135（2）:160-164.