阿霉素对兔晶体上皮细胞凋亡的诱导

中华眼科杂志 1998年第6期第0卷 论著摘要

作者：李立　李绍珍

单位：630010 重庆医科大学附属第二医院眼科(李立)；中山医科大学中山眼科中心(李绍珍)

　　细胞凋亡是一种细胞生理性死亡，当细胞受到特异性刺激后，启动内在“自杀”程序而引起的一种控制性死亡方式，又称程序性死亡。我们通过体外培养兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cell，RLEC)方法，首次从诱导细胞凋亡角度观察阿霉素对体外培养RLEC的作用。

　　1.材料与方法：25只健康新西兰白色家兔，体重0.5～0.7 kg，雌雄兼备。

　　2.方法：(1)空气颈静脉注射处死兔后，无菌条件下取出晶体囊膜并剪成小碎片移入25 ml培养瓶中培养，当培养细胞长满融合后，用0.25%胰蛋白酶液消化，按1∶2传代。(2)将终浓度为0.1、1、10 μg/ml的阿霉素分别加入传代(2或3代)培养的RLEC培养瓶中。所有实验均在细胞处于指数增长期(传代后72小时)时进行。(3)以终浓度0.01%苔盼蓝染色2分钟，计数阿霉素作用后不同时间RLEC的阳性细胞(坏死细胞)，不着色细胞(活细胞或凋亡细胞)，3次实验结果求标准误差，绘制药物剂量反应曲线，再各个样本均滴片计数100个细胞，3次实验结果求标准差，测出苔盼蓝阴性率。(4)按Danova等［1］方法，用流式细胞仪定量测定药物处理后4、8、12及16小时的细胞凋亡百分率。(5)按Hermann等［2］方法，抽提药物作用RLEC 16小时后的DNA片段并进行电泳。(6)将经阿霉素处理后不同时间的RLEC进行电镜观察。

　　3.结果：(1)RLEC药物剂量反应曲线，可见0.1～10 μg/ml阿霉素明显抑制RLEC的增殖。不同浓度阿霉素作用于RLEC 16小时后，细胞苔盼蓝染色阴性率即活细胞和凋亡细胞在90%以上，而阳性率即坏死细胞仅占10%以下。(2)流式细胞测定3种浓度阿霉素作用于RLEC的凋亡率分别为，4小时：2.2%、3.9%、5.9%；8小时：8.1%、12.5%、20.0%；12小时：16.7%、18.3%、28.0%；16小时：21.1%、33.0%、35.4%。各浓度组凋亡细胞百分率随时间的增加而逐渐增加，在16小时时为最高，而相应时间的细胞苔盼蓝阴性率在90%以上，细胞仍保持质膜的完整性，细胞死亡方式是凋亡。(3)药物作用RLEC的DNA琼脂糖电泳，可见进行性的DNA在核小体之间断裂，其特点是形成180～200 bp为最小单位的不连续片段，呈现清晰的DNA“梯子”。而对照组细胞不显示“梯子”状DNA条纹。说明阿霉素可诱导RLEC凋亡。(4)电镜观察经药物处理后的RLEC，可见细胞体积变小，细胞表面微绒毛消失，胞浆浓缩，内有许多空泡形成，染色质靠边、聚集，核膜仍光滑，呈典型的凋亡形态。

　　4.讨论：细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式，这两种细胞死亡具有不同的发生机制及形态学、生物化学特征，可用多种细胞生物学方法区别。凋亡的一个典型特征是染色质的有控降解，DNA双链在核小体连接部位断裂而形成180～200 bp的寡聚核小体，其琼脂糖电泳呈“梯子”状图谱。另一显著特征是保持细胞膜的完整性，这种膜的完整性直至凋亡小体被邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬。而坏死细胞虽然也有DNA降解，但不形成寡聚核小体，其DNA在整个分子链上随机断裂，未见染色质固缩现象。坏死细胞早期由于细胞膨胀而使细胞质膜破裂，苔盼蓝染色呈阳性，可与凋亡细胞区别。本实验表明，阿霉素一定时间内作用于RLEC除引起少数细胞坏死外，主要诱导细胞凋亡。细胞凋亡的特殊形态及改变，以电镜观察最为明显。整个细胞体积缩小，表面结构(微绒毛等)减少乃至消失，胞浆浓缩，内有空泡形成，染色质浓缩，呈新月形并凝聚在核膜周围，胞膜形成突起，细胞最后变成数个有膜包裹的凋亡小体，而被邻近细胞或吞噬细胞吞噬［3］。本实验应用电镜形态学观察的结果，证实经阿霉素处理后RLEC出现上述典型的凋亡特征。凋亡细胞存在DNA特征性断裂，在琼脂糖电泳上呈“梯子”状图谱，此为凋亡细胞的生物化学标志［4］。它是经典的检测细胞凋亡的方法，特异性高但灵敏度低，而流式细胞术测定DNA降解具有很高的灵敏度，观察凋亡细胞有特异性荧光染色减少，G1峰前出现凋亡小峰，细胞完整，线粒体有跨膜电位，蛋白质含量减少［5］。本实验检测不同浓度阿霉素作用于RLEC不同时间凋亡率，DNA片段电泳呈典型的“梯子”状图谱，进一步证实了阿霉素能诱导RLEC凋亡。我们的实验表明，阿霉素作用于RLEC后，在一定时间内(16小时)，细胞死亡方式主要是以凋亡为主，坏死极少。凋亡细胞随药物作用时间增加而增加，而坏死细胞并不随时间而增加。

　　细胞凋亡的分子基础目前仍未完全清楚，有证据表明原癌基因和抑癌基因均与细胞凋亡调控有一定关系。我们今后拟在发现阿霉素诱导RLEC凋亡的基础上，检测阿霉素诱导晶体上皮细胞凋亡的主要调控基因(如P53bcl-2、c-myc等)，如能从基因水平去激发晶体上皮细胞凋亡，从而抑制细胞增殖，则可对临床上后发性白内障的发生提供新的预防途径。

　　本课题受中华医学基金资助(基金编号93-594)

　　参考文献

　　1　Danova M, Giordano M, Mazzini G, et al. Expression of P53 protein during the cell cycle measured by flow cytometry in human leukemia. Leuk res, 1990,14：417-422.

　　2　Herrmann M, Lorenz HM, Voll R, et al. A rapid simple method for isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acids res, 1994,22：5506-5507.

　　3　Boe R, Gjertsen BT, Vintermyr OK, et al. The protein phosphatase inhibitor okadaic acid induces morphological changes typical of apoptosis in mammalian cells. Exp Cell Res, 1991,195：237-246.

　　4　Wyllie AH. glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 1980,284：555-556.

　　5　Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. cytometry, 1992,13：795-808.