目的：评估准分子激光角膜切削术后角膜伤口愈合早期的炎性反应及其的潜在作用。
材料和方法：使用193-nm准分子激光对Lewis鼠行准分子角膜切削术。中央区角膜按3个深度切削：A组，上皮；B组，浅部基质；C组，深部基质。术后1、12、24和36小时以及1周杀鼠取眼。用各类炎性细胞标记的单克隆抗体对冰冻切片行免疫组织化学检查。
结果：A组12小时、B和C组24小时可观察到重新上皮化。1周后B组和C组再生的上皮覆盖在裸露的角膜表面。术后1小时在浸润的细胞、角膜上皮细胞和内皮细胞内检测到主要的组织相容性复合物Ⅱ抗原的表达。基线检查时，在角膜缘仅有少量的巨噬细胞和Langerhans细胞。与基线相比，术后36小时在全部3组中可见到巨噬细胞从角膜缘移行到角膜切削区，数量增加2倍。在25～30小时后偶尔见到淋巴细胞浸润。
结论：巨噬细胞在激光角膜切削术后伤口愈合中起着一种积极的作用，并可能是一过性角膜雾浊的原因。
光学屈光性角膜切削术（PRK）通过重塑角膜的前表面以改变眼球的屈光率。准分子激光PRK已成为矫正屈光不正倍受欢迎的手术方式，包括近视、远视和散光。虽然此类手术是有效和安全的，具有很小的并发症，但一些患者可能发生一过性的角膜雾浊和眩光1，2。因此，研究和了解准分子激光PRK后角膜伤口的愈合过程是重要的。
以往的研究表明准分子激光PRK角膜伤口的愈合涉及到控制角膜上皮增生和新的基质胶原的沉降3～6。此外，在活体中的愈合过程涉及到角膜内各类细胞间的相互作用。准分子激光能量的物理刺激也可触发炎症反应。在本研究中，我们检查了准分子激光PRK后伤口愈合过程中炎症的反应。我们通过用鼠作为一个活体的模型系统，使用免疫组化技术，研究了在准分子激光PRK角膜愈合过程中巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞的动力学。
巨噬细胞和树突状细胞位于眼部的结膜、角膜缘、虹膜和睫状体7。它们属于单核巨噬细胞系统，其功能为处理抗原，并起到免疫效应器作用8，9。这些细胞能够释放许多细胞因子并表达粘附分子，这些分子与其它免疫系统细胞相互作用或围绕在组织周围8。Langerhans细胞是特定的树突状细胞，位居于皮肤的上皮层和角膜缘内7，8。与巨噬细胞相比，Langerhans细胞可以更有效的处理抗原，但吞噬作用较小。
根据其结构、酶活性、细胞表面特性的差异和功能，巨噬细胞分类为异种群体8，10，11。巨噬细胞的表型差异与它们的活性状态、个别巨噬细胞的发展阶段和在组织内的位置有关。使用高特异性的单克隆抗体通过鉴定细胞膜表面分子可显示出细胞的异种。这些膜分子对于研究巨噬细胞的异同和分布以及在啮齿类组织中的树突状细胞提供了极好的标记。
在本研究中，我们根据列于表1中的抗体，将角膜内的巨噬细胞和Langerhans细胞进行了特征化。我们同时研究了在准分子激光手术后的早期阶段这些细胞的动力学。据我们所知，这是首次证实在准分子激光手术后的角膜伤口愈合中巨噬细胞起着一种重要的作用。
| 表1 免疫组化分析中使用的单克隆抗体 |
| 克隆 |
特性 |
细胞类型 |
| OX6
OX42
ED2
ED3
ED1
OX62
OX19
OX40
OX33 |
抗原(共有部分决定簇)
膜多肽(CD11b)
膜抗原7
膜抗原7
髓细胞7溶酶
体膜糖蛋白
整体样蛋白限定于
淋巴和非淋巴器官8
内的树突状细胞
糖蛋白(人类CD5
同种组织)
50kd糖蛋白
白细胞共同抗原
(CD45RA) |
巨噬细胞、上皮细胞和
树突状细胞
巨噬细胞、颗粒细胞和
树突状细胞
巨噬细胞+,树突状细胞-,
单核细胞-
活化的巨噬细胞
大部分组织内巨噬细胞
(树突状细胞)
树突状细胞
全部胸腺细胞和
周围细胞
活化的CD4+T淋巴细胞
外周B淋巴细胞 |
材料与方法
动物
本研究用60只雌性Lewis鼠(Charles River实验室，Raleigh,NC），鼠龄6～8周，体重200g。笼内饲养，保持昼/夜各12小时循环，随欲喂食。建立动物的处理和实验规则如下。
激光手术
使用193nm的准分子激光（20/20 Star准分子激光系统，VISX公司，Sunnyvale,Calif），角膜上能量为160mJ/cm2，脉冲频率5Hz，分别在120只角膜中央区做1个3mm直径的切削。角膜的治疗选择3种不同的切削深度：A组，上皮，40μm深中央区的上皮切削；B组，浅表基质，40μm上皮和20μm基质切削；C组，深部基质，40μm上皮和40μm基质切削。正常情况下，鼠角膜的平均直径为6.5mm，鼠角膜基质厚度为200μm。
动物按如下时间点处死：在切削后1、12、24及36小时和1周。在每个时间点上每组至少有4只眼被处理。摘除眼球，做石蜡包埋和冰冻切片。
组织学发现
来自每个实验组每个时间点上的左眼被立即固定在4%戊二醛内30分钟，然后在处理前转换到10%甲醛内至少24小时。石蜡包埋组织，通过中央部垂直平面连续切片，苏木精-伊红染色。每组鼠眼的冰冻切片也进行苏木精-伊红染色。显微镜检查由1位不知情的作者陈之昭（C.-C.C.)进行。
免疫组织化学分析
来自每个实验组的8只眼用OCT混合物包埋（Miles公司，Elkhart,Ind)，迅速冷冻在甲基丁烷和干冰中，并储存在-70°C直至切片。冰冻切片通过视乳头-视神经平面，8μm厚度，然后放置在涂有明胶化的载玻片上。
用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体技术进行免疫组化染色10。第一抗体（Serotec公司，Raleigh，NC）列在表1内。鼠腹水IgG(2mg/L)作为一抗的对照。一抗应用到角膜冰冻切片上，孵化1小时。生物素标记的山羊-抗鼠IgG（鼠血清吸收）（美国Qualex,San Clemente,Calif）用来作为第二抗体。在用抗生素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体（Vector Laboratories,Burlingame,Calif）孵化后，切片放入3，3'-二氨联苯胺（Mallinckrodt Inc,Paris,Ky)，脱水，并用1%甲基绿在甲醇里重复染色。阳性染色的细胞由1位独立的被“蒙蔽”的观察者(C.-C.C.)评价。
分 级 系 统
为评估细胞浸润的程度，我们使用了如下分级系统：0.5+及以下，在检查区域内偶见阳性染色：1+，阳性染色细胞出现在1/5或更小的观察区域内；2+，阳性染色细胞出现在1/4至1/3或更小观察区域内；3+，阳性染色细胞出现在1/2或少于1/2至2/3的观察区域内；4+，阳性染色细胞出现在大于4/5观察区域内。
为评估在浸润时移行细胞的图形，我们将观察区分为角膜缘、周边部角膜和中央部角膜，并根据这些指标分级。
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