中华眼科杂志 2000年第1期第36卷 眼表疾病
作者：潘志强 张文华 武宇影
单位：潘志强（北京市眼科研究所 100005）；张文华（北京市眼科研究所 100005）；武宇影（北京市眼科研究所 100005）
关键词：角膜缘；干细胞；羊膜；烧伤；化学；移植；同种
【摘要】 目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植治疗角膜缘碱烧伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞原代培养后接种于羊膜，对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术，并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层；角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实：角膜缘及其周边上皮细胞为多层结构，角膜新生血管消失及基质中炎性细胞浸润减轻。结论 角膜缘干细胞羊膜移植术治疗角膜碱烧伤可恢复其角膜上皮结构的完整性，减少角膜新生血管的形成，维持角膜缘的细胞屏障功能，为进一步行角膜移植创造条件。
An experimental study on treatment of limbal alkali burn by allograft transplantation with cultured stem cells on amniotic membrane
PAN Zhiqiang, ZHANG Wenhua, WU YuYing.
（Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100005，China）
【Abstract】 Objective To study the treatment of rabbit limbal alkali burn by cultured limbal stem cells growing on amniotic membrane for allograft transplantation. Methods After the primary culture of the rabbit corneal stem cells, they were cultured on amniotic membrane in DMEM/HamF12 medium for one week. Corneal stem cells and amniotic membrane were tramsplanted on the limbal and scleral area of the rabbit model with alkali burn. The corneal changes were observed by a slitlamp everyday, and the corneal pathological changes were examined. Results Cultured rabbit corneal stem cells continued to proliferate, differentiate and form multiple cell layers on amniotic membrane. After transplantation with cultured stem cells and amniotic membrane, the rabbit epithelium showed corneal phenotype and progressive decrease of vascularity and stromal infiltration in the limbal and peripheral zone. Pathological examination verified that the limbal and peripheral corneal epithelium was composed of multilayer cells, the neo-vascularization was reduced and stromal inflammatory cells were decreased. Conclusions Allograft transplantation with cultured limbal stem cells can restore corneal epithelial cell composition, decrease neovascularization, maintain limbal cellular barrier function and provide better condition for keratoplasty later.
【Key words】 Limbus, corneae; Stem cells; Amnion; Burns, chemical; Transplantation, homologous
角膜上皮的完整性源于表浅层上皮细胞不断的脱落、死亡，角膜缘基底层的干细胞增殖和分化是取代脱落细胞的代谢过程［1，2］。眼部的化学烧伤、手术创伤及药物毒性等各种原因导致的眼前节病变，尤其是角膜缘损伤后干细胞功能障碍，致使角膜上皮反复剥脱、角膜结膜上皮化、新生血管形成及角膜混浊等［3-5］，目前角膜移植术后免疫排斥反应的发生率已高达60%～70%，导致手术失败［6］，为此我们采用培养的同种异体角膜缘干细胞对碱烧伤动物模型进行角膜缘干细胞羊膜移植术治疗，观察其治疗效果，并为进一步的角膜移植创造条件。
材料和方法
一、动物及材料
1.动物：选择新西兰大白兔25只，体重约1.5 kg。
2.材料和试剂：取正常产后的新鲜人胎盘；硝酸纤维膜；PBS液(含青霉素5×105 U/L，链霉素500 mg/L)；35 mm塑料培养皿;细胞培养基(DMEM/Ham′s F12，20%胎牛血清)；0.25%胰蛋白酶-0.04% EDTA液；眼科显微手术器械，手术显微镜等。
二、细胞准备
1.羊膜准备：取新鲜人胎盘，在无菌条件下PBS液中反复清洗干净、剥离羊膜，刮除残存的绒毛组织，再于PBS液清洗3次，将羊膜贴附于已消毒的硝酸纤维膜，绒毛面朝向硝酸纤维膜，置于4℃ 100%甘油中脱水，每24 h更换1次。储存于4℃冰箱备用。将羊膜于PBS液中水化30 min，加入0.25%胰蛋白酶，置37℃消化3 h，刮除羊膜上皮细胞，于显微镜下证实无细胞残存，PBS液清洗3次，羊膜细胞面向上平铺于塑料培养皿中。
2.细胞接种：于无菌条件下取兔眼的角膜缘，显微镜下切除残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及大部分基质，将其切成1 mm×2 mm组织块，置培养瓶中，上皮细胞面向上，加入调整后的SHEM培养基(DMEM∶Ham′s F12=3∶1，20%胎牛血清，1 000 U/L胰岛素，5 μg/L表皮生长因子，0.18 mmol/L 腺嘌呤，4 mmol/L谷氨酰胺等)，置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养，隔日更换培养基，当细胞层密度达80%～90%时进行消化传代，按1×103个细胞/mm2面积接种于铺有羊膜的培养皿中，培养条件同前；于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录。当细胞生长1周时取羊膜行组织病理学检查。
三、碱烧伤动物模型
1.麻醉：将实验兔腹腔内按每公斤体重注射10%苯巴比妥钠100 mg。
2.在无菌条件下，沿兔角膜缘环形剪开结膜并后退3 mm，将浸透1 mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片(内径8 mm，外径14 mm)置于兔角膜缘上30 s，再用生理盐水冲洗5 min，荧光素染色确定角膜缘损伤情况。
3.术后每晚结膜囊涂四环素可的松眼膏1次，每日用双氟(氟哌酸和地塞米松)眼液滴眼。定期观察角膜病变，评分标准：(1)角膜混浊：0分，角膜透明，无混浊；1分，角膜轻度混浊，虹膜纹理可见；2分，角膜中度混浊，虹膜纹理不清；3分，角膜重度混浊，隐见瞳孔；4分，角膜极重度混浊，瞳孔不见。(2)上皮荧光素染色：0分，角膜无着色；1分，角膜染色面积≤1/4象限；2分，角膜染色面积＞1/4但≤1/2象限；3分，角膜染色面积＞1/2象限≤3/4象限；4分，角膜染色＞3/4象限。(3)新生血管：0分，角膜无新生血管；1分，新生血管于角膜缘内2 mm；2分，新生血管位于角膜周边，≤1/2象限；3分，新生血管位于角膜周边，＞1/2象限；4分，全角膜可见新生血管生长。
四、干细胞羊膜移植治疗
1.动物分组：将兔角膜缘碱烧伤4周，角膜新生血管评分在3或3分以上，角膜上皮呈部分剥脱、混浊在2或2分以上的新西兰大白兔15只，随机将其分为对照组、羊膜治疗组及干细胞＋羊膜治疗组，每组5只兔。
2.手术步骤：麻醉后沿兔角膜缘剪开结膜，分离角膜和角膜缘的血管翳，暴露角膜缘后4 mm处的巩膜，局部烧灼止血。将角膜缘内外2 mm处行板层切除，分段将4 mm×7 mm生长有干细胞的羊膜片(3或4片)缝合于角膜及巩膜上，细胞面向上，将游离的结膜覆盖外周部分的羊膜，结膜下注射庆大霉素1万U及地塞米松1 mg，局部涂四环素可的松眼膏，睑裂缝合。
3.术后处理：术后每天局部滴氟哌酸、0.5%环孢素A眼液及人工泪液＋上皮细胞生长因子眼液4次，裂隙灯下观察评分(标准同前)。于术后第35天处死兔，取其眼球进行常规角膜病理学检查。
五、统计学处理
本文数据采用SPSS for Windows 6.0统计软件处理，统计学方法为独立样本t检验。
结果
一、角膜缘干细胞生长情况
组织块接种后细胞很快呈膜状扩展生长，约术后第10天时达到生长高峰，细胞大小一致，呈多角形，具有角膜上皮细胞的典型形态特征。将含有角膜缘干细胞的细胞悬液接种于有羊膜的塑料培养皿中24 h，可见细胞大部分贴壁，术后第3天后细胞融合为单层，术后第7天组织学染色可见羊膜上细胞密集，部分显示为多层细胞结构。
二、角膜缘碱烧伤动物模型情况
碱烧伤后第3天兔角膜缘缺损大部分修复，荧光素染色仅见点染(图2)。1周后角膜缘可见新生血管逐渐长入；2周时新生血管进入角膜近中央区；4周后，全角膜可见新生血管，且基质有明显浸润，部分上皮细胞剥脱伴结膜上皮化。
三、干细胞羊膜治疗的情况
羊膜干细胞移植术后第7天，拆除睑缘缝线，可见角膜表面平整，荧光素染色部分点染，仍可见充盈的新生血管，结膜充血(++)；术后2周角膜新生血管明显减少；4周时角膜无结膜上皮进入，可见新生血管已退至角膜缘。病理学检查证实，角膜缘可见多层上皮细胞形成，基质浸润减轻，新生血管减少，羊膜下组织中可见少量炎性细胞浸润。单纯羊膜移植治疗的兔角膜结膜上皮覆盖角膜缘，对照组中角膜仍然为新生血管。3组角膜病变评分见图9～12，可见干细胞移植治疗组的角膜新生血管和上皮修复与对照组间比较差异有显著性 (t值分别为16.50和11.73，P＝0.000)，3组术后角膜病变总评分均值分别为：对照组9.67±1.20、羊膜组8.02±1.16、干细胞羊膜组6.37±1.37，干细胞移植组与对照组和羊膜治疗组比较差异显著，(t值分别为21.34和15.39，P=0.000)，表明干细胞移植可以显著减轻角膜病变；羊膜组与对照组比较差异有显著性(t=8.33，P=0.000)，主要为上皮光滑和新生血管减少。
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