中华眼科杂志 1999年第2期第35卷 论著
作者：钟一声 蒋幼芹 熊小玲
单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院眼科
关键词：视网膜神经节细胞；细胞；培养的；抗原；THY-1
【摘要】 目的 建立视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的体外培养方法, 为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法 采用胰酶消化法将16只生后2～3天的Sprague-Dawley 大鼠视网膜制成细胞悬液后，接种于涂以鼠尾胶原的24孔培养板，预先置入1 cm×1 cm的载玻片。细胞数约4×105个/孔，在37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养。于第1、3及5天行抗大鼠THY-1单克隆抗体免疫细胞化学检查以鉴定RGCs，镜下计算每1 0个高倍镜下(high power,HP)RGCs 的细胞数和其轴突生长率。结果 在鼠尾胶原上培养的RGCs生长良好，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接成网。培养第1天，RGCs数和轴突生长百分率分别为(401±9)个/10 HP和(25.34±0.72)％，第3天为(351±6)个/10 HP和(35.16±2.22)％，第5天为(109±8)个/10 HP和(69.84±0.97)％。结论 RGCs的体外培养能获成功， 鼠尾胶原是RGCs体外生长的良好支持物。
Rat retinal ganglion cells in culture ZHONG Yisheng, JIANG Youqin, XIONG Xiaoling. Department of Ophthalmology, Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
【Abstract】 Objective To establish a culture system for retinal ganglion cells (RGCs) in order to lay a foundation for the experimental research in vitro.Methods The retinae of 16 postnatal 2～3 day Sprague-Dawley rats were dissected into cell suspension with trypsin digestion. The cell suspension was implanted in 24 well culture plates with a cover slide 1 cm2 in size and covered with murine tail collagen preplaced in each well (4×105 cells/well) and cultured under 37℃ in an incubator with 5% CO2. The cells were identified by immunocytochemical method with anti-rat Thy -1.1 monoclonal antibody after culture for 1, 3, 5 days, respectively, and the number of RGCs and its axon-growth percentage were counted in each 10-field high power (HP, 200 x) view under light microscope.Results The RGCs cultured in murine tail collagen tissue grew very well. Some cells possessed axons and some axons connected in networks. The RGC number and its axon-growth percentage were (401±9) cells/10 HP and (25.34±0.72)% in 1-day-culture, (351±6) cells/10 HP and (35.16±2.22)% in 3-day-culture, (109±8)cells/10 HP and (69.84±0.97)% in 5-day-culture, respectively.Conclusion RGCs can be cultured successfully and the murine tail collagen tissue is a good substratum for RGC survival in vitro.
【Key words】 Retinal ganglion cells Cell，cultured Antigen,Thy-1
视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)是青光眼病理性损害的主要细胞。一般认为，RGCs的死亡可导致视功能不可逆性损伤,研究RGCs损害的细胞学和分子生物学机制,有利于青光眼发病机制研究。有研究证实，神经节细胞损伤后在一定条件下其轴突可以再生［1，2］, RGCs培养成功可为青光眼研究提供最直接的实验手段,从而为体外研究青光眼的损害机制、探讨青光眼的预防和治疗方法提供新思路。鉴于此, 我们于1995年起在自制鼠尾胶原培养板上，成功培养了大鼠RGCs，现将结果报告如下。
材料和方法
一、鼠尾胶原的制备
参照王子淑［3］方法制备鼠尾胶原, 在无菌条件下将Sprague-Dawley大鼠鼠尾切成小段,剥去毛皮,抽出尾腱置平皿中,剪碎尾腱,浸入0.1%醋酸溶液150 ml中,置4℃冰箱,不时振摇。48 h后,移入灭菌离心管内(4 000 r/min)离心30 min,取上清液分装入小瓶,低温冰箱保存。
二、培养板的处理
为了对培养细胞行免疫细胞化学鉴定,培养板内预先置入1 cm×1 cm的载玻片。涂胶方法: 用吸管将胶原液均匀涂于24孔培养板(美国Coster公司产品)后,向孔内充入氨气片刻,待胶原与氨气作用30 min后胶原凝固,然后用D-Hank液反复冲洗, 晾干后即可使用。
三、RGCs悬液的制备
1.分离神经层视网膜组织：取16只生后 2～3天的Sprague-Dawley大鼠(湖南医科大学实验动物中心提供),分4次实验,每次4只, 将其颈椎脱位致死,消毒后轻轻摘出眼球,置入含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hank液内漂洗3次。在显微镜下,沿角巩缘剪除角膜, 用镊子去除晶体及玻璃体,然后钝性分离出神经层视网膜组织。
2.消化视网膜组织：用D-Hank液(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)对视网膜漂洗3次,置入0.08%胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)，于37℃下消化30 min,加入10%小牛血清的DMEM培养液终止消化。
3.制备细胞悬液：将上液以300 r/min离心，共3～5 min,弃去上清液,加入培养液(80%DMEM、20%胎牛血清、6 mg/ml葡萄糖、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 μg/ml二性霉素、25 mmol/L氯化钾及10 mmol/L Hepes液)约8 ml, 用钝头吸管吹打使之成为细胞悬液,行细胞计数, 调整培养液量使每ml含(6～7)×105个细胞。
四、接种培养
将每次实验的细胞悬液接种于预先经鼠尾胶原处理的3块24孔培养板内,每组1块随机培养1、3及5天。每孔约0.6 ml RGCs悬液(细胞数为4×105个/孔),置于体积分数为5%的CO2培养箱内，于37℃下培养。12～24 h后,加入5-溴-2′-脱氧尿苷(20 μg/ml，美国Sigma公司产品)以抑制非神经细胞生长,48 h后更换培养液,每天于倒置显微镜下观察细胞生长过程及形态变化。
五、RGCs鉴定方法
1.形态学观察:每天于Olympus 倒置显微镜下观察活细胞形态。
2.细胞免疫化学检查:取培养1、3及5天的细胞行抗大鼠THY-1单克隆抗体(美国Sigma公司产品) 免疫细胞学检查,同时设立阴性对照组。方法: 每次实验用的3块24孔培养板中,每板随机取6块覆有细胞的载玻片,其中4块为实验组,2块为阴性对照组,实验组用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)清洗1或2次,4%多聚甲醛液固定2 h后,用含5%羊血清的PBS清洗3次,加入抗大鼠THY-1单克隆抗体(1∶20, PBS稀释)；阴性对照组加入含1%牛血清白蛋白的PBS,置于4℃冰箱过夜,PBS清洗3次后,加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶100, PBS稀释)，置室温下1 h,PBS清洗3次,加入不含过氧化氢的邻苯二胺，置于暗处反应30 min后,加入含0.005%过氧化氢的邻苯二胺液显色5 min,PBS清洗终止反应,光镜下观察，随机计数每10个高倍镜下（high power,HP）(200倍)胞膜完整的阳性染色细胞数及阳性染色细胞中有轴突生长细胞的百分率(即RGCs轴突生长率)。
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