讨论

　　一、RGCs培养的现状

　　自Raff等^［4］采用完全消化法于体外成功地培养了生后2～3天大鼠RGCs以来,许多学者曾先后对其进行过研究^［5，6］。目前常使用猫眼和鼠眼作为培养RGCs的材料来源,一般选用生后1～8周的猫或生后2～7天的鼠眼视网膜,此阶段的RGCs与中枢连接已经形成,且细胞已经特异化^［6，7］。 本研究选取生后2～3天的Sprague-Dawley 大鼠视网膜细胞,在实验操作过程中尽量保持组织新鲜，以利于细胞存活。

　　RGCs的原代培养国内尚未见报道, 其主要的原因是神经细胞培养需要神经生长因子,且价格昂贵,加之神经细胞较难成活, 技术条件要求较高，故行原代培养较困难。我们通过调整DMEM 培养液中葡萄糖和氯化钾的浓度,适时增加谷氨酰胺和胎牛血清, 成功地使乳鼠RGCs在体外存活5天,较周明华等^［8］采用RPMI1640和6%胎牛血清培养乳鼠RGCs 存活期延长3天,更利于体外实验研究。

　　二、培养板、皿的处理

　　RGCs的培养需要对培养物品进行处理,以利于其贴壁生长。Takahashi等^［9］ 采用先培养胶质细胞单层后,再接种RGCs的方法,以有利于其长期存活,但其缺点是培养时镜下难以辨认和分离RGCs。有学者将载玻片覆以聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、Cell-Tak(一种生物聚合体)、板素和多聚鸟氨酸等进行处理,其中以聚-L-赖氨酸和板素最常见^［6，8］。赵丽萍等^［10］比较鸡胚前脑细胞在各种支持物上生长的情况显示各种支持物促前脑细胞生长的顺序依次为:人羊膜上皮面＞鼠尾胶原＞多聚鸟氨酸＞板素＞纤维连接蛋白＞人羊膜基底面＞I型胶原,但羊膜作为支持物时在显微镜下难以分辨细胞轮廓,而鼠尾胶原透明, 易于获得,本实验亦证明采用自制鼠尾胶原作为RGCs生长支持物可成功地培养鼠RGCs。

　　三、THY-1抗原与RGCs的鉴定

　　THY-1抗原是存在于啮齿类动物许多细胞表面的一种糖蛋白,鼠大脑和胸腺存在高浓度的THY-1抗原,大鼠视网膜THY-1 抗原表达开始于胚胎19天,且仅仅表达在RGCs 和其突起上,RGCs THY-1抗原表达直至生后14天才开始增加,其增加与内丛状层的厚度增加相平行，认为RGCs THY-1抗原表达与其轴突伸长、树突生长及与靶组织上丘开始建立突触联系有关^［5］。Barnstable等^［11］发现THY-1抗原是啮齿类动物RGCs特异性的标记物。Takahashi等^［9］亦用抗鼠THY-1单克隆抗体鉴定鼠RGCs。本实验采用抗鼠THY-1单克隆抗体免疫细胞化学方法鉴定鼠RGCs,表明染色阳性细胞为RGCs。

　　本课题受国家自然科学基金资助（基金编号39570752）

　　参考文献

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　　3　王子淑，主编.动物细胞遗传实验技术.成都 :四川大学出版社,1987 .381-382.

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　　6　Montague PR,Friedlander MJ. Expression of an intrinsic growth strategy by mammalian retinal neurons. Proc Natl Acad Sci USA ,1989,86:7223-7227.

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　　8　周明华,赵丽萍. 中脑顶盖提取液对培养在不 同支持物的初生大鼠视网膜神经细胞生长的影响.解剖学报,1991,22:195-198.

　　9　Takahashi N,Cummins D,Caprioli J. Rat retinal ganglion cells in cultures. Exp Eye Res,1991,53:565-572.

　　10　赵丽萍,周明华.鸡胚前脑细胞在各种支持物特别是人羊膜基底膜上生长的定量研究.解剖学报,1989,20:56-59.

　　11　Barnstable CJ,Drager UC. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience,1984, 11: 847-855.

(收稿: 1998-03-24　　修回:1998-10-30)

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