中华眼科杂志 1999年第1期第35卷 眼表疾病

作者：潘志强　张文华　孙葆忱

单位：100730　北京市眼科研究所

关键词：角膜缘；干细胞

　　【摘要】　目的　了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性，检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法　采用DMEM和F₁₂培养基进行兔角膜上皮细胞培养，用克隆形成率(colony-forming efficiency, cFE)、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果　角膜缘干细胞(limbal stem cells, LC)在本培养条件下能够正常传代生长5代，CFE为(5.07±2.35)%，而角膜中央上皮细胞(central corneal epithelial cells, CC)仅第1次传代生长，CFE为(1.12±0.86)%；LC冻存后复苏率为(0.43±0.22)%，CC为(0.16±0.07)％，差异有非常显著性(t=-5.54,P＜0.01)；上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, eGF)在质量浓度为5 ng/ml和20 ng/ml时对细胞的促增殖作用最强(t=-6.51,P＜0.01)。干细胞在培养初期，细胞角质蛋白K3染色阴性，第2、3代时逐渐表达；而蛋白质免疫印迹检测早期(原代，第2代)为阳性，晚期(第4代)为阴性。结论　角膜缘干细胞在体外培养的初期更有利于进行干细胞移植治疗和药物筛选

A study on proliferation and differentiation of limbal stem cells

PAN Zhiqiang, ZHANG Wenhua, SUN Baochen.

　　Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100730

　　【Abstract】　Objective　To study the proliferation and differentiation of limbal stem cells (LCs) in vitro and examine the effects of epithelial growth factor (EGF) on cell proliferation.Methods　The cells were cultured in DMEM/F12 medium. The proliferation and differentiation of cultured cells were studied by colony-forming efficiency (CFE), immunohistochemistry staining and Western blot examination.Results　LCs could be passaged 5 times in this culture condition. The CFE of stem cells was (5.07±2.35)%, while that of the central epithelial cells (CCs) was (1.12±0.86)%. The rates of freezing and recovery were (0.43±0.22)% in LCs and (0.16±0.07)% in CCs. Limbal stem cells could be stimulated to proliferate better by EGF at the concentration of 5 and 20ng/ml. The staining of keratin 3 (K3) to stem cells in the primary culture was negative, but positive in the second and third passages. However, the expression of K3 by Western blot examination was positive in the primary and second passages but negative in the fourth one.Conclusion　It is better for limbal stem cells to be used for transplantation and drug screening in the primary culture.

　　【Key words】　Limbus cornea　　Stem cells

　　角膜上皮完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞，上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动源于角膜缘基底层的干细胞增殖和分化^［1,2］。由于干细胞对角膜创伤的愈合及透明性维持等方面具有重要作用^［3］，通过对体外培养的角膜缘干细胞增殖分化特性的研究，可以加深对干细胞的认识，为将来进行异体干细胞移植准备条件。

　　材料和方法

　　1.兔角膜上皮细胞的培养：无菌条件下取新西兰大白兔眼角膜，显微镜下切除残存的结膜和色素组织，将角膜分为中央和角膜缘组织(角膜缘内2mm)，去除角膜内皮细胞后，将组织切成1 mm×2 mm，细胞面向上置于培养瓶中，加入细胞培养基(DMEM和Hams F₁₂培养基的1∶1混合物，20%胎牛血清)，在37℃、体积分数为5% CO₂和95%空气条件下进行培养，培养基每2天更换1次，10～12天去除接种组织块。当细胞形成单层达80％～90％时，用0.25％胰蛋白酶和0.04％ EDTA液消化传代(1∶2)。

　　2.干细胞的细胞克隆形成率(colony-forming efficiency，CFE)和影响因素：原代培养的细胞消化成单个细胞，2％台盼蓝染色测定活细胞活力，按每孔1×10³细胞数接种于24孔培养板，每6孔为一组，每培养板设对照、5、20、100 ng/ml质量浓度的上皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)共4组；角膜缘干细胞和角膜中央上皮细胞各接种3个培养板，每组18孔，接种后第2天加入EGF，第4天开始在倒置显微镜下观察，以细胞团超过4个细胞为一个克隆形成^[4]。

　　3.培养细胞的冻存和复苏：(1)细胞冻存：细胞消化成单细胞悬液，体积分数为15％甘油培养基常规-80℃保存。(2)细胞复苏：细胞取出后在40～42℃水浴1分钟，将细胞接种于24孔板，按每孔1×10³细胞，于培养后1周在倒置显微镜下观察。

　　4.免疫组化染色：(1)兔眼球摘除后置10％中性甲醛固定24～48小时，常规石蜡包埋切片。(2)不同培养时期生长于盖玻片上的角膜中央上皮细胞和角膜缘细胞按Schermer等^［5］方法进行染色。一抗为抗角质蛋白K3鼠单抗AE5(美国Tung-Tien Sun教授馈赠)，二抗为辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG，3.3二氨基联苯胺显色，质量浓度为1%甲基绿复染，镜检摄像。

　　5.Western Blot分析：不同培养阶段的细胞，常规裂解细胞，用超声细胞处理仪对DNA进行剪切，收集上清液进行蛋白电泳，电转移蛋白至硝酸纤维素膜。用AE5进行抗原抗体反应，设PBS为阴性对照^［6］。

　　6.实验数据经SPSS for Windows 6.0统计软件处理，采用t检验和多因素方差分析等统计方法。

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