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结果
1.细胞培养：组织块接种后细胞很快呈膜状扩展生长，约10天达生长饱和，细胞大小一致，呈多角形，角膜缘和角膜中央上皮细胞的形态相同，仅后者细胞略大(图1,2)。不同的是角膜中央上皮细胞在传第1代后细胞基本停止生长，细胞从多角形变为长梭形，不能形成细胞单层(图3)；而角膜缘上皮细胞能够保持增殖至第3～5代后才逐渐丧失上皮细胞形态，生长停止(图4)。
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图1 角膜缘上皮细胞原代培养第10天 ×100
图3 角膜缘上皮细胞传第3代培养第7天 ×200 |
图2 角膜中央上皮细胞原代培养第10天 ×100
图4 角膜中央上皮细胞传第1代第10天 ×100 |
2.干细胞的增殖能力：统计分析显示，EGF和细胞类型对CFE的影响差异有显著性(F=60.55，P＜0.01)(表1)。
表1 不同质量浓度EGF对兔角膜上皮细胞
CFE的影响(n=18)
| EGF
质量浓度
(ng/ml) |
角膜缘
干细胞
( ±s，%) |
角膜中央
上皮细胞
(±s，%) |
t值 |
| 对照 |
5.07±2.35 |
3.12±1.06 |
-7.83 |
| 5 |
6.03±2.14 |
3.74±1.18 |
-9.75 |
| 20 |
6.11±1.83 |
4.42±1.38 |
-7.66 |
| 100 |
4.76±1.36 |
2.99±1.10 |
-10.49 |
注：对照组与不同质量浓度EGF各组间及角膜缘干细胞与角膜中央上皮细胞间比较，P＜0.01 本结果为不同时间CFE的平均数。角膜中央上皮细胞在接种后1周内CFE达到高峰(图5)，随后逐渐下降，而角膜缘干细胞的CFE逐渐升高，至接种后10～12天达到高峰，两者比较角膜缘干细胞的增殖潜力明显高于角膜中央上皮细胞；而不同质量浓度的EGF对角膜上皮细胞增殖均有影响，以5和20 ng/ml质量浓度对促进干细胞增殖作用显著(t=4.02,P＜0.01)，100 ng/ml质量浓度作用8天后抑制细胞增殖(t=4.14，P＜0.01)。
图5 兔角膜上皮细胞增殖曲线及EGF的影响
3.细胞冻存复苏率：按常规细胞冻存复苏方法，细胞复苏后CFE分别为角膜中央上皮细胞的(0.16±0.07)％、角膜缘细胞的(0.43±0.22)％，两者比差异有显著性(t=5.54,P＜0.01)。
4.角质蛋白K3表达：在正常兔角膜组织切片的免疫组化染色中，角膜缘基底层细胞角质蛋白K3不表达，表现为细胞染色呈绿色，而表浅细胞则为阳性呈棕黑色，并且越向角膜中央上皮细胞层角质蛋白K3表达越多，在中央上皮基底细胞也可见角质蛋白K3表达(图6～9)。盖玻片上生长的角膜缘上皮细胞在原代培养基本不表达角质蛋白K3(图10)，在传2代细胞时大部分表达角质蛋白K3呈棕黑色(图11，12)。而角膜中央上皮细胞在早期即表达K3。
通过蛋白质免疫印迹检测分析发现，角膜缘干细胞在原代和第2代时能够检测到角质蛋白K3的表达，至第4代时角质蛋白K3为阴性，而角膜中央上皮细胞在原代和传第1代均表达K3， 并且传第1代 细胞表达更明显(图13)
图6 正常兔角膜上皮表达角质蛋白K3的兔疫组化染色，示角膜缘 ×100
图7 示图6角膜周边
图8 示图6角膜中周区
图9 示图6角膜中央
图10 角膜缘干细胞原代培养AE5染色阴性 ×100
图11 角膜缘干细胞第2代AE5染色阳性 A×100，B×400
图12 角膜中央上皮细胞AE5染色阳性 A原代×100，B传第1代早期×100
M示标准蛋白 1示角膜缘干细胞原代培养 2示干细胞传第2代培养
3示干细胞传第4代培养 4示角膜中央上皮细胞原代培养 5示角膜中央传第1代培养 6示角膜基质细胞传第1代培养 7示正常兔角膜上皮细胞(阳性对照) 8示PBS(阴性对照)
图13 兔角膜上皮细胞表达角质蛋白K3的蛋白质印迹
讨论 1.干细胞的增殖能力：1986年Schermer等［5］检测确定角膜缘基底细胞中部分细胞是唯一不表达角质蛋白K3的角膜上皮细胞，从而证实角膜干细胞位于角膜缘基底部。我们采用造血干细胞的脾CFE测定细胞增殖率显示，角膜缘干细胞在培养早期CFE较低，随着对培养环境的适应其增殖潜力逐渐发挥出来，明显较中央上皮细胞高，与Ebato等［7］的研究结果类似。细胞冻存复苏后测定的角膜上皮细胞CFE显示，角膜缘干细胞明显高于角膜中央上皮细胞。然而，由于细胞冻存复苏率普遍偏低，因此有待进一步研究新的细胞保存方法以满足实验的需要。
在EGF的作用下，角膜缘干细胞的增殖能力提高超过角膜中央上皮细胞，尤其是在质量浓度为5～20 ng/ml时作用明显，而在质量浓度为100 ng/ml时作用则相对下降，说明该EGF在体外对角膜上皮细胞的促增殖作用有量效关系［8］。
2.干细胞的分化特点：正常角膜上皮组织中角膜缘基底细胞不表达角质蛋白K3是角膜缘干细胞的特性之一，与本研究结果一致。并且原代培养的角膜缘干细胞不表达角质蛋白K3，是因为角膜上皮细胞在培养条件下丧失了表达角质蛋白K3的能力，随着对培养环境的适应细胞逐渐分化表达［9］，保持着角膜上皮细胞的特征，而角膜缘基底细胞具有进一步增殖分化的潜力，可以完成向角膜上皮细胞转化的过程［7］，角膜中央上皮细胞已经处于细胞分化的高级阶段，所以在原代培养时可以部分表达K3。然而，蛋白质免疫印迹显示，角膜缘干细胞在培养早期即有角质蛋白K3的表达，可能一方面是该检测方法敏感性高，少量角质蛋白K3即能测出；另一方面因为培养的角膜缘细胞中干细胞仅为其中的一小部分，主要仍然是角膜上皮细胞，加之该方法是对大量细胞混合物的检测，所以细胞表现为阳性结果。
本研究表明，离体培养的角膜缘干细胞在培养的初期(第1、2代)与体内角膜干细胞具有相同的特征，即增殖能力高、具有干细胞固有的分化特征，适合于进行角膜干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症，以及作为药物筛选的细胞模型。
参考文献
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[2] Kruse FE. Stem cells and corneal epithelial regeneration. Eye, 1994, 8:170-183.
[3] Pfister RR. Corneal stem cell disease: concepts, categorization and treatment by auto-and homo-transplantation of limbal stem cells. CLAO J, 1994, 20:64-72.
[4] Kruse FE, Tseng SC. A serum-free clonal growth assay for limbal, peripheral, and central corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32:2086-2095.
[5] Schermer A, Galvin S, Sun TT. Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. J Cell Biol, 1986, 103:49-62.
[6] 卢圣栋, 主编. 现代分子生物学实验技术. 北京: 高等教育出版社，1993. 403-406.
[7] Ebato B, Friend J, Thoft RA. Comparison of limbal and peripheral human corneal epithelium in tissue culture. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1988, 29: 1533-1537.
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[9] Kiritoshi A, SundarRaj N, Thoft RA. Differentiation in cultured limbal epithelium as defined by keratin expression. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32:3073-3077.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-10) 上一页 [1] [2] |
