中华眼底病杂志 1999年第4期第15卷 论著

作者：张群芳　童绎　卢光琇　余龙　王小柯

单位：410078 长沙，湖南医科大学人类生殖工程研究室(张群芳、卢光王　秀)；福建医科大学附属第一医院眼科(童绎)；复旦大学遗传研究所(余龙、王小柯)

　　关键词： 视神经萎缩，遗传性／诊断；聚合酶链反应；DNA，线粒体；点突变；序列分析

　　【摘要】　目的　探讨线粒体DNA(mtDNA)11778、3460、14484位点突变与遗传性视神经病(Leber′s hereditary optic neuropathy,Leber病)之间的关系。　方法　应用多聚酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测临床一对可疑Leber病同卵双生子患者及其亲属，有突变者，对突变序列进行序列测定。　结果　PCR-SSCP检测同卵双生子及母亲11778、3460位点所在的DNA区段存在突变，14484位点所在的DNA区段均未检出突变，将11778位点所在DNA区段克隆后测序显示11778位点仍为CGC，但发现一个新的突变位点(11915T→A)。　结论　Leber病发病机制为mtDNA点突变。多位点突变也被看作为Leber病的病因。11915位点可能也是多位点突变之一。可用PCR-SSCP对临床有视神经萎缩和视神经炎可疑为Leber病患者(包括家系成员)做出遗传性视神经病的基因诊断。

　　中国图书资料分类法分类号：R774．6　R446．1

Primary mutation detection of mitochondrial DNA(mtDNA)in Leber′s hereditary optic neuropathy patients

ZHANG Qunfang,TONG Yi,LU guangxiu,et al.

　　^*Human reproductive engineering Laboratory,Hunan Medical university,Changsha 410078,China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship between mitochondrial DNA 11778、3460 and14484 point mutations and clinical characteristics of patients with Leber′s hereditary optic neuropathy.　Methods 　PCR-SSCP and direct mutation sequencing were used to detect mitochondrial DNA 11778、3460 and 14484 mutation in monozygotic twins suspected of Leber′s diseases and their relatives.　Results　PCR-SSCP showed the monozygotic twin patients and their mother had point mutation at mtDNA 11778 and 3460,but there was no mutation at 14484.DNA sequencing showed 11915 locus had a T→A nucleotide mutation.　Conclusions　Leber′s disease results from point mutation in mitochondrial DNA.Multi-point mutations which may include 11915 were also related to Leber′s disease.PCR-SSCP can be used in patients who have optic neuropathy and are suspected of Leber′s disease for gene diagnosis.

　　【Key words】　Optic atrophy,hereditary／diagnosis　　Polymerase chain reaction　　DNA,mitochondrial　　Point　mutation　　Sequence　analysis

　　Leber病是由于线粒体DNA(mtDNA)的点突变所致的遗传病，目前国外报告LHON有13个位点的突变，其中包括11778、3460和14484这三个原发突变。国内张丽珊、周海林等仅研究11778位已知的G→A突变，本研究对一同卵双生子疑似Leber病家系11778，3460，14484三位点同时检测，国内有关3460，14484位点突变尚属首先报告，同时发现一个新的突变位点(11915 t→A)。

　　1　临床资料

　　Leber病的诊断依据是：视力、眼底、视野及VEP等，并排除颅内占位性病变。

　　1.1　实验组 8人，其中2人为同卵双生子，视力进行性明显减退患者(12岁)，另6名为视力正常亲属。其父母为家族联姻(姨表兄妹)(图1)。

图1　莆田市郑氏Leber病家系图

　　fig.1　Pedigree of Zheng with Leber′s disease in Putian,Fujian province

　　1.2　对照组 1人，视力正常，来自正常人群。

　　2　方法

　　2.1　提取线粒体　用DNAzol一步法提病例标本外周血白细胞DNA(内含线粒体DNA)。

　　2.2　PCR扩增11778，3460，14484位点引物核苷酸序列

　　P₁ 5′—AGCCCTCGTAGTAACAGCCA—3′(L链Pos11641—11660)

　　P₂ 5′—GGAGTATAGGGCTGTGACTA—3′(H链Pos11980—11961)

　　P₃ 5′—CACACCCACCCAAGAACAGGG—3′(Pos3206—3226)

　　P₄ 3′—TCGTCATCGGGTTTGTTAGAG—5′(Pos3708—3728)

　　P₅ 5′—TCAACCAGTAACTACTACT—3′(Pos14200—14218)

　　P₆ 3′—GGTATATTGGAGGGGGTTT—S′(Pos14519—14538)

　　PCR循环条件：总体积50　μl，94℃变性0．45秒，55℃复性0．45秒，72℃延伸0．55秒，30次循环，最后72℃延伸7分钟。

　　2.3　非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳　PCR扩增产物5　μl与加样缓冲液3　μl混匀煮沸变性7分钟，冰浴骤冷2分钟，上样(8%胶、8　℃、200　V)，电泳至二甲苯蓝走至胶2/3处，PAG银染，拍照。

　　2.4　突变片段的克隆及验证　回收PCR产物，制备线性化PUC18质粒载体，将二者连接后重组PUC18质粒转化DH5α，筛选。

　　2.5　序列测定　用Pharmacia公司的T₇噬菌体测序试剂盒(T₇ sequencing kit)，以重组质粒为模板，以Sanger双脱链终止法测序，试剂盒抽提重组质粒(mini-DNA purification system,Promega公司产品)，每次测序α-³⁵S-dATP用量为10　μCi。测序时模板量5　μg，引物量10　pmol，测序用6%变性聚丙烯酰胺凝胶。

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