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3 结果
3.1 11778，3460，14484三位点PCR扩增分别出现340bp、522bp、339bpDNA条带。用PCR-SSCP检测含11778位点DNA片段，同卵双生子Ⅳ3，4及其母亲Ⅲ1出现四条单链DNA条带，而正常对照及家系视力正常成员Ⅲ2、Ⅳ1、Ⅳ5、Ⅳ6、 Ⅳ7均出现六条单链DNA条带，提示前者含11778位点的DNA片段存在点突变(图2，3)。3460位点DNA片段PCR-SSCP也检出点突变，同卵双生子及其母亲两条单链DNA条带，其余为六条(图4)。14484位点DNA片段PCR-SSCP未检出突变(图5)。
3.2 将突变片段克隆(图6)、测序，11778位点仍为CGC(图7)，但11915位点出现一新的突变(T→A)，(图8)；14484位点DNA片段克隆后测序，确定无突变(图9)。
M:Molecular Standard Mark of 100bp DNA
result from PCR amplification of mtDNA 11778 position(1，patient；2，normal)；result from PCR amplification of mtDNA 3460 opsition(3，patient；4，normal)；result from PCR amplification of mtDNA 3460 position(5，patient；6，normal)
图2 PCR products containing mtDNA 11778、3460、14484 position
fig.2 电泳检测含11778，3460，14484三位点PCR产物
N，normal；Ⅳ3，Ⅳ4the monozygotic twin patients；Ⅲ1，Ⅲ2，Ⅳ1，Ⅳ5，Ⅳ6，Ⅳ7 their relatives.
图3 含11778位点线粒体DNA片段PCR-SSCP结果
fig.3 PCR-SSCP of PCR product containing mtDNA
11778 position
N:正常对照，Ⅳ3、Ⅳ4为同卵双生子患者，其余为家系中视力正常成员
n，normal；Ⅳ3、Ⅳ4 the monozygotic twin patients；Ⅲ1，Ⅲ2，Ⅳ1，Ⅳ5，Ⅳ6，Ⅳ7 their relatives.
图4 含3460位点线粒体DNA片段PCR-SSCP结果
fig.4 PCR-SSCR of PCR product containing mtDNA
3460 position
N，normal；Ⅳ3，Ⅳ4 the monozygotic twin patients；Ⅲ1，Ⅲ2，Ⅳ1，Ⅳ5，Ⅳ6，Ⅳ7 their re-latives
5 含14484位点线粒体DNA片段PCR-SSCR结果
Fig.5 PCR-SSCP of PCR product containing mtDNA 14484 position |
M：Molecular Standard Mark of 100bp DNA：1. result from PCR amplification of recombinant pUC18 plasmid DNA;2.enzyme analyzing of recombinant pUC18 plasmid DNA(EcoRI+PstI);3.enzyme analyzing of recombinant pUC18 plasmid DNA(EcoRI);4.result from PCR amplification of mtDNA 11778 position
6 重组pUC18质粒DNA的PCR鉴定及酶切鉴定结果
Fig.6 Identifying with PCR and enzyme analyzing of recombinant pUC- 18 plasmid DNA |
 
图7 11778位点DNA序列
fig.7 DNA Sequence of 11778
 
图8 11915位点DNA序列(“←”处为T→A突变)
fig.8 DNA sequence of 11915(“←”showed 11915 locus had T→A nucleotide mutation)
 
图9 14484位点DNA序列
fig.9 DNA Sequence of 14484
4 讨论
1988年，Wallace等［1］首先证实Leber病是由mtDNA突变造成的，鉴定出mtDNA第11778位核苷酸碱基改变，由G→A，由编码精氨酸变为组氨酸。Vilkki等［4］也证实了Wallace的发现。11778位点的突变较为常见，国内张丽珊［3］、郭莉等［4］仅研究11778位点已知的G→A突变，而未研究3460、14484等位点的突变，并且是采用PCR后酶切的方法。本研究对11778、3460、14484三个位点同时检测，国内对3460、14484位点的研究尚属首先报告。
1991年Huoponen等［5］首先在Leber病患者的mtDNA发现了ND1基因的3460位点突变G→A，由编码丙氨酸变为苏氨酸。1992年Johns等［6］首次发现14484位点mtDNA突变。1993年Huoponen等发现多个线粒体DNA突变在Leber病发病时相互作用，多位点突变也被看作为Leber病的病因［7］。本实验对同卵双生子及其母亲的mtDNA经过PCR-SSCP检测表明11778、3460位点所在DNA片段有点突变存在，也证实了11778、3460多位点突变是Leber病的病因。两个同卵双生子发病，其母亲视力尚正常，眼底无改变，为携带者，说明该突变严格地通过遗传，由女性向后代传递，具有母系遗传和倾向于男性发病的特点。
我们将11778突变片段及14484位点的正常片段克隆入pUC18质粒中，克隆产物直接测序，发现11778位点没有最常见的G→A突变，但发生了11915位点T→A新突变，由编码苯丙氨酸变为酪氨酸，在国内外Leber病中未见有此位点突变。
PCR-SSCP是目前最常用的检测点突变的方法，1995年日本学者Mashima［8］也用该法研究了Leber病患者。PCR-SSCP结合测序对临床有视神经炎和视神经萎缩可疑有Leber病的患者(包括家系成员和散在病例)的早期诊断与鉴别诊断有重要意义［9］。
参考文献
1 Wallace DC,Singh G,Lott MT,et al.Mitochondrial DNA mutation associated with Leber′s hereditaty optic neuroretinopathy.Science,1988,242:1427-1430.
2 Vilkki J,Savontaus ML,Nikoskelainen EK.Genetic heterogeneity in Leber hereditary optic neuroretinopathy revealed by mitochondrial DNA polymorphism.Am j Hum Genet,1989,45:206-211.
3 张丽珊，黄鹰，李方圆，等.中国人Leber遗传性视神经病家系线粒体DNA突变的研究.中华医学杂志，1994，74：349-351.
4 郭莉，郭向明，陈又昭，等.Leber视神经萎缩分子生物学检测.中华眼底病杂志，1998，14：156-158．
5 Huoponen K,vilkki J,Aula P,et al.A new mtDNA mutation associated with Leber hereditary optic neuroretinopathy.Am J Hum Genet,1991,48:1147-1153.
6 Johns DR,Neufeld MJ,Park RD.Cytochrome C oxidase mutations in Leber hereditary optic neuropathy.Biochem Biophys Res Commun,1992,187:1551-1557.
7 Huoponen K,Lamminen T,Juvonen V,et al.The spectrum of mitochondrial DNA mutations in families with Leber hereditary optic neuroretinopathy.Hum genet,1993,92:379-384.
8 Mashima Y,Saga M,Hiida Y,et al.Quantitative determination of heteroplasmy in leber′s hereditary optic neuropathy by single-strand conformation polymorphism.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1714-1720.
9 张群芳，童绎，卢光王 秀.Leber病分子生物学研究进展.国外医学 眼科学分册，1999，2：97-101.
(收稿：1998-11-09 修回：1999-02-02) 上一页 [1] [2] |
