中华眼底病杂志 1999年第2期第15卷 增生性玻璃体视网膜病变研究
作者：刘兵 惠延年 黄蔚
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院眼科
关键词： 玻璃体视网膜病，增生性；色素上皮，眼；细胞死亡；神经生长因子/分析受体，神经生长因子/分析；肿瘤坏死因子/分析
【摘要】 目的 检测增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)玻璃体切割液标本内是否存在细胞凋亡，观察Fas抗原(Fas)和Fas配体(Fas ligand，FasL)与细胞凋亡的关系。 方法 11例PVR新鲜玻璃体切割液标本细胞离心涂片，末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine 5-triphosphate nick-end labelling，TUNEL)染色检测凋亡细胞，以及Fas、FasL和细胞类型特异抗原细胞角蛋白(cytokeratin,CK)免疫组织化学检测，并与2例角膜移植后的供体眼正常对照标本的上述检查结果相对比。 结果 正常人视网膜Fas和FasL弱表达。Fas、FasL、CK和凋亡见于所有PVR玻璃体切割液标本。TUNEL阳性细胞占总细胞数的20.53%。70.35%、51.58%和82.97%的细胞分别高表达Fas、FasL和CK。Fas和凋亡的直线相关系数为0.99(P＜0.001)。 结论 PVR眼玻璃体切割液标本可见Fas、FasL的表达和细胞凋亡。Fas和FasL的高表达可能与PVR中增生的视网膜色素上皮细胞凋亡有关。
中国图书资料分类法分类号 R774.1 R446.62
Apoptotic cells in vitrectomy specimens of proliferative vitreoretinoathy
LIU Bing,HUI Yannian,HU ANG wei.Department of Ophthalmology,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical university,Xian 710032,China
【Abstract】 Objective To observe whether apoptosis was involved in cells of aspiration fluid from vitrectomy for proliferative vitreoretinopathy(PVR),and whether there was an association with expression of Fas antigen(Fas)and Fas ligand (FasL). Methods Cytocentrifuge slides of 11 fresh vitreous specimens of PVR were prepared to be stained by tUNEL method for detection of apoptosis and by immunohistochemical technique for detection of Fas,FasL，and cytokeratin (CK),a cell-type specific antigen. Results Fas and FasL were expressed in normal human retina.Fas,FasL,CK，and apoptosis were found in all preparations.TUNEL-positive cells were 20.53% in total cells.70.35%,51.58%，and 82.97% of cells highly expressed Fas,FasL，and CK respectively.The linear correlation coefficient of Fas and apoptosis was 0.99(P＜0．001). Conclusion Vitrectomy specimens of PVR showed expression of Fas，FasL，and apoptosis.Prominent Fas and FasL expressions may be associated with apoptosis of proliferating retinal pigment epithelial cells in the vitreous of PVR.
【Key Words】 Vitreoretinopathy,proliferative Pigment epithelium of eye Cell death Nerve growth factors/analysis Receptors,nerve growth factor／analysis Tumor necrosis factor/analysis
增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的实质是眼内细胞过度增生［1］。细胞增生与死亡失衡可能是引起PVR的原因。诱导增生细胞凋亡，可能为临床防治PVR开辟一条新路。Fas抗原及其配体作为细胞凋亡的一个重要系统已有较多研究［2-4］。我们通过对PVR玻璃体切割液中细胞Fas抗原及Fas配体免疫组织化学染色及凋亡细胞的TUNEL检测，观察Fas抗原及其配体系统与PVR眼玻璃体内的细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 玻璃体切割液的收集 11例PVR(C级5例，D级6例)，均使用Storz公司premiere玻璃体切割机，切速600～750次/min，吸力300mmHg（1mmHg＝0．133kPa），切割灌注液为眼用平衡盐液。术毕收集玻璃体切割液，用高速冷冻离心机4℃、3 000 r/min，离心10分钟，弃上清；800r/min，再离心5分钟，细胞离心涂片，－20℃保存备用。Fas 阳性标本取自一慢性乙肝及肝硬化患者的肝组织。FasL阳性标本取自小鼠胸腺。2例正常对照标本取自角膜移植后的供体眼球。上述标本经10%福尔马林固定，常规酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，5μm切片，－20 ℃保存备用。
1.2 试剂与主要仪器 兔抗人Fas及抗人和鼠的Fas配体多抗(美国Santa cruz公司)，鼠抗人细胞角蛋白(CK)单抗(中国中山公司)，TUNEL试剂盒(美国Oncor公司)，SPTM试剂盒(美国ZYMED公司)，Olympus显微镜(日本)，细胞离心涂片机(Cytospin3，英国Shandon)，全自动高速冷冻离心机GL20A(湘西仪器仪表总厂科学仪器厂)。
1.3 免疫组织化学染色 采用过氧化酶标记的链霉卵白素染色系统。将低温保存的标本在0.01mol/L磷酸盐平衡液(phosphate-buffered saline，PBS)(pH7.4)中浸泡5分钟。0.3%曲安通溶液室温孵育15分钟，漂洗。3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育10分钟，漂洗。10%正常羊血清湿房内37 ℃封闭30分钟，分别加入第一抗体(Fas 1∶50，FasL 1∶50，CK 1∶100)，湿房内4 ℃过液，漂洗；第二抗体(1∶00)湿房，37 ℃，30分钟，漂洗；辣根酶标记链霉卵白素(1∶100)湿房，37 ℃，30分钟，漂洗；3，3-二氨基联苯胺-4盐酸(3，3-diaminobenzidine-4 HCl，DAB)显色，自来水冲洗，苏木素复染，常规酒精脱水，透明，封片，显微镜下阅片，照相。
石蜡标本常规脱蜡至水，余步骤同上。11例细胞离心涂片标本均有不加第一抗体染色的阴性对照。
1.4 TUNEL染色［5］ 细胞涂片入水，蛋白酶K 20 μg/ml，消化15分钟。3%H2O2-PBS溶液5分钟，50 μl平衡液I(buffer1，TUNEL试剂盒)1分钟。含末端脱氧核苷转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)6 μl的反应液20 μl，37 ℃，湿盒孵育1.5小时。预热的中止反应液，37 ℃，30分钟，中止反应，buffer1漂洗15分钟，2次；加2%正常羊血清37 ℃，湿盒孵育20分钟，抗地高辛碱性磷酸酶抗体，37℃温盒孵育2小时；buffer 1，平衡液Ⅲ(buffer 3，TUNEL试剂盒)中分别振荡漂洗，新鲜配制显色液，暗处过夜显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。
1.5 阳性细胞计数 抗Fas、FasL、CK阳性染色均位于细胞浆内，为棕黄色，细丝状，分布不均匀，细胞核淡染，呈浅灰蓝色。凋亡细胞阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色。每例选择20个高倍镜视野，用网格测试法按公式计算阳性细胞百分率：阳性细胞百分率=Σ阳性细胞数/Σ高倍镜视野内细胞数×100%。
1.6 统计学分析 直线相关分析，t检验。
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