中华眼底病杂志 1999年第2期第15卷 论著摘要
作者：镡鲁滨 韩丽荣 张传森 徐瑞生 韩传贵
单位：266071 青岛，解放军第401医院眼科（镡鲁滨）；第二军医大学长海医院眼科（韩丽荣、韩传贵）；解剖教研室（张传森、徐瑞生）
关键词： 糖尿病视网膜病变／病理生理学；疾病模型，动物；美拉德反应；糖基化终产物，高级／分析视网膜血管／病理生理学
中国图书资料分类法分类号 R771．3 R329．4
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病晚期的严重并发症之一。最近研究［1-3］：糖和蛋白等的非酶结合，通过Maillard反应，形成的糖化终产物（advanced glycation end products，AGEs），与糖尿病的许多并发症有关。我们实验观察非酶糖化抑制剂对糖尿病大鼠视网膜微血管形态学改变的影响，初步探讨糖尿病视网膜微血管重建的发生机制。
1 材料和方法
1．1 糖尿病动物模型的建立 选鼠龄2月，雄性SD大鼠，体重170～200 g，用0．5 mmol／L的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液（pH＝4．5），配制成2％STZ溶液，按55 mg／kg体重，腹腔内一次性注射，注射后第2天、第7天采尾血测血糖，以后每2周测一次血糖和体重，将血糖浓度大于16．7 mmol／L的大鼠定为糖尿病模型。
1．2 实验分组和饲养 将大鼠分为三组：糖尿病组（n＝18）；糖尿病治疗组（n＝18），按Kg／日用氨基胍100 mg／kg，饮水喂养；正常对照组（n＝18）。各组均在标准条件下铁笼中喂养，饲养至8周、16周、24周。
1．3 视网膜消化铺片的制备 用20％乌拉坦，腹腔内注射麻醉，颈动脉插管，剪破下腔静脉，先后用生理盐水和4％多聚甲醛固定液灌注，取眼球置于固定液中固定24小时以上，沿锯齿缘环形剪开眼球，分离出视网膜，清水冲洗后，放入pH＝7．4tris缓冲液溶解的3％胰蛋白酶（difco 1∶250）溶液内，37℃温箱内孵育2～3小时，再将视网膜移入蒸馏水中冲洗去残留的视网膜神经成份，倒置显微镜下观察到一层菲薄的半透明的血管网，将其移至载玻片上，自然干燥，HE染色，封片备用。
1．4 观察指标 采用中科院自动化研究所CA-6300型通用颗粒图像分析系统进行图像分析：将视网膜血管网铺片通过摄像系统输入计算机，并在显示屏中显示出来，内皮细胞核呈椭圆形，染色淡；周细胞核呈圆形，染色深。用计算机计算视网膜微血管壁周细胞和内皮细胞核投影面积。将标本置于光学显微镜下，随机取6个视野，油镜下计算每个视野中周细胞和内皮细胞的数量，取其平均值。各数据均行统计学处理。
2 结果
随着病程的延长，在24周时，糖尿病组视网膜微血管壁周细胞的数量较8周和16周明显减少（P＜0．05），与正常对照组比较明显减少（P＜0．05）。周细胞核面积较正常对照组明显增大（P＜0．01），核染色变淡，密度不均，形态不规则。而氨基胍治疗组周细胞数量、核面积、形态与正常对照组相比无显著改变（P＞0．05）（表1）。内皮细胞数量及核面积的改变各组间及不同病程间相比，差异均无显著性（P＞0．05）（表2）。
表1 三组大鼠不同病程周细胞数量及面积的变化（ ±s）
与对照组比：P＜0．05 不同时程间比：△ P＜0．05 △△ P＜0．01
表2 三组大鼠不同病程内皮细胞数量及面积的变化（±s）
| 时间
（周） |
眼数
（只） |
糖尿病组 |
治疗组 |
对照组 |
| 数量（n） |
面积（μm2） |
数量（n） |
面积（μm2） |
数量（n） |
面积（μm2） |
| 8 |
12 |
6．84±0．82 |
25．51±3．32 |
6．67±0．82 |
26．10±3．32 |
6．69±0．73 |
25．36±2．98 |
| 16 |
12 |
6．20±0．65 |
26．63±4．52 |
6．38±0．76 |
26．89±4．51 |
6．77±0．71 |
26．91±3．11 |
| 24 |
12 |
5．80±0．83△ |
29．96±4．68△△ |
6．12±0．79 |
27．76±4．46 |
7．10±0．85 |
27．03±3．05 |
| 时间
（周） |
眼数
（只） |
糖尿病组 |
治疗组 |
对照组 |
| 数量（n） |
面积（μm2） |
数量（n） |
面积（μm2） |
数量（n） |
面积（μm2） |
| 8 |
12 |
21．90±5．13 |
26．71±2．81 |
21．63±5．01 |
26．10±3．32 |
21．97±3．89 |
26．88±3．51 |
| 16 |
12 |
22．23±4．45 |
27．69±3．44 |
22．47±4．52 |
26．89±4．51 |
22．04±4．10 |
27．70±4．21 |
| 24 |
12 |
22．74±3．93 |
28．01±4．52 |
22．51±4．07 |
27．26±4．23 |
22．08±4．22 |
28．16±4．05 |
3 讨论
我们通过用胰蛋白酶消化的大鼠视网膜铺片观察糖尿病早期视网膜微血管结构的重建，发现在糖尿病8周、16周时，周细胞的数量及细胞核大小与正常对照组相比无显著改变。到24周时，周细胞数量明显减少，细胞核面积增大，核着色变浅，密度不均，形态不规则，与对照组比较差异显著。而内皮细胞的数量和形态，与对照组比较无显著性。提示糖尿病最早的视网膜血管改变，主要为周细胞的损害。本实验观察发现：用氨基胍喂养的糖尿病大鼠，在病程24周时，周细胞、内皮细胞的数量及形态改变与正常对照组相比，差异无显著性（P＞0．05）。氨基胍是一种非酶糖化抑制剂，无降血糖作用，但能减少AGEs的形成。其可能的机制是：①氨基胍分子上的-NH2竞争性地抑制蛋白上-NH2发生非酶糖化；②氨基胍与早期糖化产物Amadori结合，阻断其进一步反应生成AGEs［4］。本研究的结果提示了AGEs在DR病变过程中起着重要作用。
4 参考文献
[1] Browlee M，Gerai A，Vlassara H．Advanced glycosylationend pro-ducts in the tissue and the biochemical basis of diabitic complication．N Eng1 J Med，1988，318：1315-1321．
[2] Vlassaba H，Bucala R，Striker L，et al．Pathogenic effects of advanced glycosylation．Laboratory Investigation，1994，2：138-151．
[3] Still AW，Li YM，Thomas A， et al．Advanced glycation end products（AGEs） colocalize with AGE receptors in the retinal vasculature of diabitic and of AGE-infused rats．Am J Pathol，1997，150：523-528．
[4] Hammes HP，Martin S，Federlin K，et al．Aminoguanidine treatment inhibits the development of exeperimental diabitic retinopathy．Proc．Natl Acad Sei USA，1991，88：11 555-11 558．
（收稿：1998-10-05 修回：1999-01-25） |
