【摘要】目的：观察氩绿激光对兔视网膜损伤及修复的组织学改变及对兔视网膜感光细胞凋亡的影响。 方法:将8只有色兔（16眼）中每只眼的上、下方视网膜随机分配为激光光凝区及空白对照区，光凝后24h、4wk通过光镜和电镜及TUNEL技术观察视网膜改变及感光细胞凋亡。 结果:(1)光镜观察：光凝处视网膜损伤不明显但脉络膜小静脉充血，4wk后消退。（2）电镜观察：光凝处外节膜盘排列稀疏，神经节细胞轻微肿胀，外核层细胞异染色质增多，4wk后色素增殖，胶原增生。（3）TUNEL染色观察：光凝后24h，光凝处外颗粒层可见较多阳性细胞，内颗粒层偶见，4wk后接近正常。（4）感光细胞凋亡率：光凝后24h，感光细胞凋亡率较正常对照组增加，差异有统计学意义（P<0.01）。光凝后4wk较24h凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论：轻度氩绿激光光凝视网膜损伤轻微。
关键词:氩激光；视网膜光凝；损伤；兔
引言
随着社会的老龄化，年龄相关性黄斑病变是60岁以上患者视力损害的主要原因[1]。目前尚无理想的治疗方法，为预防其发生国外学者应用氩绿激光光凝视网膜，促使其早期病变——玻璃膜疣消退。但视网膜在吸收激光能量后会产生一系列病理改变，甚至会产生不可逆损伤以致永久视力损害。因此玻璃膜疣消退的原因和激光对视网膜损伤的程度是学者们关注的问题。为了解氩绿激光在眼底产生淡灰白反应时对视网膜的损伤程度，本课题对成年有色兔正常视网膜进行514nm氩激光光凝，从形态学、组织学及免疫组织化学等方面，观察激光光凝后视网膜的损伤和修复情况以及感光细胞的凋亡。
1材料和方法
1.1材料 健康成年有色兔8只16眼，质量1.8～2.2kg，雌雄不限，由新疆医科大学动物实验中心提供，双眼前节和眼底检查均正常。氩离子激光机（美国Coherent公司），双目生物显微镜（日本Olympus公司），JEOLJEM1230型透射电子显微镜（日本JEOL公司）。
1.2方法 用2.5g/L托吡卡胺滴眼液散瞳,30g/L戊巴比妥钠溶液按1mL/kg经兔耳缘静脉麻醉后,角膜置广角眼底接触镜。以水平方向有髓神经纤维为界将视网膜分为上、下两区，随机分配为激光光凝区及空白对照区，并以视盘为中心,距视盘2PD作10×10个光斑的光凝区,光斑直径200μm，光斑间隔一个光斑距离，曝光时间0.1s。实验表明要得到淡灰色反应的光斑，激光能量须在50～55mW。激光后24h、4wk用空气栓塞法随机各处死4只兔，摘除眼球，取出眼前节及玻璃体，两组中随机各取3只(6眼)投入100g/L甲醛中固定，常规切片，HE染色，光镜观察。其余制片封胶以备TUNEL染色。另快速准确地切取各组中其余1只(2眼)光凝组织，40g/L戊二醛液固定，制片方法见参考文献[2]，透射电镜观察超微结构变化。细胞凋亡原位检测试剂盒（德国宝灵曼公司）检测细胞凋亡。切片常规脱蜡至水洗，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，加入胃蛋白酶溶液室温孵育30min以修复抗原，PBS冲洗3次。室温下置于3mL/L过氧化氢甲醇溶液30min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，卵蛋白孵育30min，加50μL的TUNEL反应混合液，在37℃湿盒中孵育60min。PBS冲洗3次，加入50μL转化剂–过氧化物酶，37℃湿盒中孵育30min，PBS冲洗3次，加入50μL,3′二氨基联苯胺四盐酸（DAB）底物溶液，室温孵育30min。苏木精染色2 min，常规脱水透明后封片。
TUNEL切片在高倍镜下从光斑外颗粒层挑选三个不同位置，计数感光细胞数及阳性细胞数，取其平均值并计算凋亡率。感光细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
统计学处理：采用SPSS 13.0进行统计分析，所有参数用±s表示。定量资料符合正态分布和方差齐性，进行t检验和方差分析，否则采用秩和检验，P＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1光镜观察 氩激光光凝后视网膜各层均未见明显改变，但光凝处视网膜呈丘状隆起，其下脉络膜毛细血管、小静脉充血。光凝后4wk视网膜变平，其下充血减轻，未见典型的瘢痕增生。
2.2电镜观察 光凝处外节排列稀疏，外核层细胞间隙增大，内核层变化不明显，RPE内质网轻微扩张、线粒体肿胀。光凝后4wk，外节排列稍稀疏，外核层恢复正常，RPE及脉络膜内色素颗粒增殖。脉络膜内成纤维细胞排列不整齐，尚未见呈束的胶原纤维。
2.3 TUNEL染色观察 正常兔视网膜均为阴性，细胞核呈蓝色，阳性凋亡细胞核被染成棕黄色。光凝后24h外颗粒层可见较多阳性细胞而内颗粒层较少。光凝后4wk阳性细胞消失。
2.4感光细胞凋亡率 光凝后24h，光凝处感光细胞凋亡率较正常对照增加（P＜0.01）。光凝后4wk，光凝处凋亡细胞偶见，感光细胞凋亡率较光凝后24h显著降低（P＜0.01，表1）。
表1光凝后不同时间各激光组视网膜感光细胞凋亡率（略）
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