【摘要】 随着分子生物学技术的进步和基因遗传学的发展，慢病毒载体系统不断地得到改良及优化，并以其特有的优势，逐渐成为眼科基因治疗的良好载体之一，由于其来源特殊，其生物安全性也备受关注。目前慢病毒已应用于多种眼科疾病的基因治疗研究中，并取得较好成果，为许多疾病的治疗带来了希望，但是我们要将其真正应用于临床，还任重而道远。
【关键词】 慢病毒;基因治疗;病毒载体;眼科疾病
Lentiviral vectors for gene therapy of ocular diseases
Wei Li, Ling Gao
Department of Ophthalmology, Xiangya the Second Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
Correspondence to: Wei Li. Department of Ophthalmology, Xiangya the Second Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China. [email protected]
AbstractThe capacity of efficiently transfecting nondividing cells, shuttling large genetic payloads, and maintaining stable longterm transgene expression attributes the lentiviral vectors to the forefront of gene delivery vehicles for research and therapeutic applications in a clinical setting. However, now their biosafety is of major concern because of their special source. We discussed the development of lentiviral vectors and described the key features of them that made them such useful tools for gene therapy, and outlined the major breakthroughs in the potential use of such vectors for treating chronic ocular disease.
KEYWORDS:lentivirus;gene therapy;vectors;ocular diseases
0引言
随着医学技术的发展，采用药物、手术、激光等方法虽然可以有效治疗糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）、年龄相关性黄斑变性（agerelated macular degeneration, AMD）的晚期并发症如视网膜新生血管、玻璃体积血和牵引性视网膜脱离等，却无法纠正其原发基因缺陷，从而大幅度地改善患者的视功能。尤其是先天性遗传性疾病如视网膜色素变性、Best’s病和Stargardt’s病的治疗缺乏确切的疗效。随着基因遗传学研究的深入和分子生物学技术的进步，基因治疗成为目前国内外研究热点，也为这些疾病的治疗带来了曙光。基因治疗成功的关键之一在于载体的选择，目前慢病毒载体以其特有的优势已逐渐成为广为关注的热点。
1慢病毒载体分类、生活周期及发展[1 4]
慢病毒载体可以分为灵长类来源和非灵长类来源两大类，灵长类来源的包括人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV ）、猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）来源的载体，而非灵长类来源包括马免疫缺陷病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）、猫免疫缺陷病毒（feline immunodeficiency virus, FIV）、牛免疫缺陷病毒（bovine immunodeficiency virus, BIV）来源的载体。其中对HIV1型载体系统的研究最为广泛和深入，下面就以其为例介绍一下其生活周期。HIV1基因组长约9.7 kb，在5’端有帽结构，3’端有多聚(A)尾。除了具有逆转录病毒[5]的基本结构基因长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)、gag（衣壳蛋白）、pol(病毒复制酶)、env(外膜糖蛋白)外，基因组还含有非常复杂的调控机制，包括 tat、 rev、 nef、 vif、 vpr、 vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV1表达的蛋白一部分构成病毒颗粒的组成部分(如Vif、Vpr、Vpx)，一部分参与病毒基因的调节(如Tat、Rev)，此外有些病毒蛋白与细胞相互作用启动病毒增殖(如Vpu、Nef)。这一独特性对于HIV1与宿主间长期相互作用及产生慢性活动性感染具有决定性作用。慢病毒首先要通过其病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上特异性的受体结合发挥作用。灵长类慢病毒的主要受体为CD4和辅助受体，后者分两类：一类是CC型辅助受体（CC chemokine receptor），如CCR1、CCR2、CCR3、CCR5；另一类是CXC型辅助受体（CXC chemokine receptor），如CXCR4。病毒通过与CD4及辅助受体中的任何一个相互作用感染辅助T淋巴细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、树枝状细胞和郎罕细胞。一旦与细胞受体结合，病毒膜和细胞膜融合。随之病毒颗粒结合的基质和衣壳蛋白分解，核蛋白复合物被转运到细胞内，在胞浆中开始逆转录，以单链RNA为模板合成双链线性DNA。一旦线性病毒DNA的合成完成，在3’端和5’端的病毒整合酶特异性的切割和催化下，将之整合到宿主基因组中，成为宿主永久的遗传成分。这种整合的病毒双股DNA即前病毒。当前病毒被活化而发生自身转录时，LTR起着启动和增强其转录的作用。在宿主RNA聚合酶的作用下，病毒的DNA转录为RNA并分别经拼接、加帽或加尾形成HIV的mRNA或子代病毒RNA。mRNA在宿主细胞核糖体上翻译蛋白质，经进一步酶解、修饰等形成病毒结构蛋白gag、pol或调节蛋白rev、tat和nef等；子代RNA则与病毒结构蛋白装配成核衣壳，在从宿主细胞释出时获得包膜，成为具有传染性的子代病毒。目前供研究用的慢病毒载体的转移质粒结构中不含gag/pol，后者由包装质粒提供。因此，转移质粒一旦整合到宿主细胞，它就无法直接产生gag/pol，不能产生新的子代病毒，从而保证了其生物安全性[6]。慢病毒载体还通过与不同的包膜蛋白结合可以改变其与细胞亲和性或转导细胞方式，如水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSVG）可以与细胞表面普遍存在的磷脂成分（磷脂酰肌醇、磷脂丝氨酸及GM3神经节）结合而进入细胞内，使慢病毒载体有很广的宿主范围[7]；利用狂犬病毒G蛋白包膜的马免疫缺陷病毒可使其具备逆向转运的能力，这一优势可使其应用于大脑或脊髓神经细胞，在该神经支配的肌肉处注射后，其可通过逆向转运而到达神经终末端的靶细胞，这一优势使其在脑和脊髓等神经系统的基因治疗的应用中有了新的价值[8]。
第一代慢病毒载体来源于HIV，将HIV的 env基因分裂或删除，插入外源性异种病毒启动子如猿猴病毒40（simian virus,SV40），而引入VSVG包膜，提高了病毒滴度以及对多种组织的侵袭力，从而拓展了逆转录病毒的应用范围，但是因其结构与原始病毒很相近，很难应用于临床[911]。第二代慢病毒则将质粒一分为三，删除了病毒基因组的大部分致病成分，保留了病毒携带目的基因转染、逆转录及转基因长期表达的遗传特性,同时减少了辅助蛋白表达的副作用和免疫反应，其主要包含三种不同结构的质粒，分别是转移质粒(transfer vectors)，辅助质粒(helper plasmids)，包膜表达质粒(envelop expression plasmids),这种最小化系统已应用于HIV,ELAV和FIV来源的载体[1]。而目前应用最为广泛的第三代HIV1来源的慢病毒载体，则采用四质粒系统，质粒一（如pMDL/pRRE）携带了两个结构基因 gag/pol编码序列及Rev效应元件(Rev responsive element,RRE);质粒二(如RSVRev)包含了病毒蛋白表达调节子rev 的序列;质粒三（如pRRL.SIN18）是载体质粒;质粒四（如pMD.G）表达结构基因 env。该系统减少了辅助质粒和载体质粒的同源性，将其必需的三个结构基因 gag/pol和 rev编码序列隔离，分散在不同的质粒上，并除去反式激活因子tat，从而既保证了病毒的转染效率，又减少了产生复制型病毒的可能性，增加了载体系统的安全性[3,4]（图1 6）。
2慢病毒载体的优势[1214]
慢病毒载体与以往的逆转录病毒载体不同，它能同时感染分裂和非分裂细胞，包括造血干细胞、神经干细胞和处于终末分化的神经元等，而且较腺病毒载体的免疫反应小、可重复应用，其转移基因片段容量大，可达10kb，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体，并且能长期而稳定地表达，有报道可长达2a。它可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的“管家基因”的启动子。这些特点吸引了越来越多的学者的关注，并逐渐扩展到基因治疗的许多领域。
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