【摘要】目的：观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外大鼠Müller细胞的影响。方法：体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞。台盼兰染色测定细胞活性。应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间（0~24 h）、添加不同浓度VEGF（10～100 μg/L）及VEGF受体Flk-1阻断剂SU1498处理后，细胞中VEGF和Flk-1，Flt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化。 结果：纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白（GFAP）染色增强，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，可见细胞肿胀、脱落。缺氧20h时，与对照组相比，细胞增生降低到79.3％，细胞凋亡指数增加了6.5倍。缺氧24h 前加入75μg/L VEGF使细胞活性增强了1.3倍，凋亡指数下降到2/3。VEGF在10～75μg/L范围内此作用呈剂量依赖性。正常情况下，Flk-1，Flt-1表达很少，但是缺氧后，表达量明显上升，Flt-1更显著。加入SU1498后能部分抑制VEGF对Müller细胞的作用。结论：短时间缺氧使Müller细胞反应性增生，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，外源性VEGF可能部分地借助于受体Flk-1和Flt-1对缺氧的Müller细胞起到保护作用。

   【关键词】  血管内皮生长因子　Müller细胞　血管内皮生长因子受体1　血管内皮生长因子受体2　缺氧　保护

　　 Effects of exogenous vascular endothelial growth factor on rat Müller cells under hypoxia in vitro

    Xiao-Juan Liu, Yan-Nian Hui, Bin Guo, Le Zhang, Xiao-Feng Hao

    Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

    Abstract AIM: To observe the effects of exogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) on primary cultured rat Müller cells under hypoxia in vitro. METHODS: The rat Müller cells were purified by digestion of the trypsin solution, cultured and identified by cellular morphology and glial fibrillary acidic protein (GFAP). The cell viability was detected by trypan blue staining. The cells were treated with VEGF at different concentrations (10-100μg/L) as well as with VEGF receptor (Flk-1) inhibitor SU1498. The cells were then exposed to hypoxia for up to 24 hours. Light microscopy, MTT assay, TUNEL labeling and SABC immuno-histochemistry were used to measure the changes of cell morphology, growth, apoptosis, and the expressions of VEGF, Flk-1 and Flt-1. RESULTS: The Müller cells were purified from mixed cells (purity>90%, viability>87.3% in Passage 3) and passaged serially. After hypoxia for 8-12 hours, the proliferation and viability of the cells increased progressively, and the expression of GFAP, VEGF, Flk-1 and Flt-1 also increased. But the increased cells showed swelling and suspended in the culture medium. After hypoxia for 20 hours, the proliferation rate decreased to 79.3% and apoptosis index increased 6.5 fold as that of controls. When the concentration of VEGF in cell culture medium reached 75μg/L, the cell viability increased 1.3 fold and the apoptosis index reduces to two third as that of controls. This effect of VEGF on the cells appeared dose dependent (10-75μg/L VEGF). In normal conditions, Flk-1 and Flt-1 expressed at a low level, while after hypoxia, their expressions were significantly increased. The protective effect of VEGF was inhibited in part by SU1498. CONCLUSION: Hypoxia could induce reactive activity of the Müller cells and the expressions of GFAP, VEGF, Flk-1 and Flt-1. The exogenous VEGF may exert neuroprotective effects partially on the Müller cells via VEGF receptor-Flk-1 and Flt-1 in vitro.

    · KEYWORDS: vascular endothelial growth factor; Müller cells; Flk-1; Flt-1; hypoxia; neuroprotection

　　 0引言

    血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），又称血管通透因子，是目前发现的一种强有力的血管生成和血管渗透促进因子。它选择性作用于血管内皮细胞膜上的2种Ⅲ型酪氨酸激酶受体（VEGFR-1/flt-1和VEGFR-2/KDR/flk-1），能高度特异地促进血管内皮细胞有丝分裂和血管形成[1-3]。研究发现，VEGF在血管发生和对神经元保护方面起到重要作用，如在缺血缺氧性脑血管疾病中，VEGF不仅能够诱导血管形成，促进侧支循环[4]，抑制神经细胞凋亡[5]，还能通过VEGF受体对星形胶质细胞发挥保护作用[6]。在缺血性视网膜疾病中，多种视网膜细胞分泌大量的VEGF[1]，而VEGF是促进新生血管生成的主要生长因子，尽管VEGF抑制剂如bevacizumab等已应用于临床治疗，但是仍存在很多问题待进一步研究，如VEGF对Müller细胞的影响。我们研究缺氧条件和外源性VEGF处理后，Müller细胞中VEGF及Flt-1，Flk-1的表达，以期初步揭示缺氧条件下VEGF对Müller细胞的影响。

    1材料和方法

    1.1材料 健康封闭群二级SD新生大鼠10只，由第四军医大学实验动物中心提供。培养Müller细胞的培养基DMEM和MTT试剂分别购自Gibco和Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司，GFAP抗体、VEGF受体Flk-1、Flt-1的抗体和VEGF抗体购自博士德公司；VEGF购自北京中杉公司；SABC试剂盒购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 依据改良的视网膜Müller细胞制备方法[7-10]。眼球取自出生1wk内SD大鼠，显微镜下无菌操作取出大鼠视网膜组织，PBS冲洗，于2.5g/L胰蛋白酶中37℃消化15min，过双层的53μm尼龙筛网，400g离心10min，用含有100mL/L胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM中和，400g离心10min。加入100mL/L FBS的DMEM 1.5mL吹打细胞，悬浮接种于培养皿中，加入含有200mL/L FBS的DMEM培养液，培养于37℃，50mL/L CO2，950mL/L 空气，3d换液，待细胞融合，加入含1g/L胰蛋白酶，待细胞收缩，部分细胞悬浮后，将其吸出弃掉，加入含200mL/L FBS的DMEM培养液继续培养。如此2～3遍，细胞形态基本一致后，按1∶2比例进行传代，传3～4代后行免疫组织化学技术鉴定细胞：一抗为兔抗大鼠胶质源纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP），二抗是FITC标记的抗兔IgG抗体，荧光显微镜观察。细胞纯度分析：计算单位视野内GFAP表达阳性的细胞占总细胞的比例。细胞活力分析：台盼兰染色，活细胞率＝拒染细胞数/（拒染细胞数＋染色细胞数）×100％。

    1.2方法 缺氧模型的制作参照文献[11]，将氯化钴（CoCl2, Sigma产品）用去离子水溶解，配成200μmol/L的溶液，经过滤除菌后-4℃备用。将经纯化鉴定传至3~5代融合前的Müller细胞接种于培养板中，培养24h后再置于缺氧条件下培养24h，或缺氧前加不同浓度的VEGF继续培养24h，实验结束后取出培养板，根据检测指标不同进行处理。盖玻片经PBS洗后多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱备用。细胞随机分组：(1)空白对照组：培养的Müller细胞不做任何处理；(2)缺氧组：加入CoCl2 200μmol/L，以建立Müller细胞化学缺氧模型。根据缺氧时间（0，4，8，12，16， 20，24 h）观察缺氧对细胞的影响；(3)VEGF组：分别在正常氧环境和缺氧24h之前加入10，25，50，75和100μg/L VEGF，继续培养24h 后观察对缺氧的Müller细胞的影响；(4)SU1498组：缺氧前24h时加入75μg/L VEGF的同时加入700μg/L SU1498，观察SU1498的影响。不同时间结束实验后，2.5g/L胰酶消化，收集细胞，血球计数板计细胞总数。调整细胞密度为105/L，接种于96孔板，每孔100μL，24h后分别加入10，25，50，75和100μg/L VEGF，继续培养24h 后每孔加入5g/L MTT试剂20μL，继续培养4h后弃培养液，加DMSO 100μL，振荡混匀15min，用酶标仪（λ＝480 nm）测定每孔A值（A值与活细胞数成正比），取其平均值，记录结果。

    1.2.1免疫细胞化学法 将培养板中各个时间点的盖玻片取出，PBS浸洗，100mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶， 1∶20的血清封闭20min，滴加1∶50稀释的一抗，一抗为VEGF和Flk-1，Flt-1兔抗大鼠多抗，4℃下过夜，PBS振洗，滴加生物素化的二抗， 37℃ 孵育20min，PBS振洗，滴加SABC复合剂，37℃孵育20min，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。PBS代替一抗作阴性对照。镜下选择10个高倍视野计数阳性Müller细胞（细胞着棕黄色），并经图象分析仪检测各指标染色的积分吸光度。

    1.2.2 TUNEL标记法 使用原位细胞凋亡检测试剂盒（罗氏公司），检测方法参考操作说明。细胞爬片经PBS洗后，3mL/L H2O2甲醇溶液孵育30min，1mL/L TritonX-100通透液冰浴2min，滴加Tunel反应液（1:10的TdT酶溶液和核苷酸混合液），37℃孵育60 min，再滴加碱性磷酸酶转换液50μL，37℃孵育30min后，DAB显色，苏木精复染后封片。阴性对照是以标记液代替Tunel反应混合液；阳性对照用DNA酶Ⅰ（Sigma）。结果判断：每张切片镜下随机选10个视野，每个视野观察100个细胞，计数Tunel阳性细胞数（细胞核呈棕黄色颗粒），并计算凋亡细胞指数（Tunel阳性细胞数／细胞总数）。

    统计学处理：实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS10软件统计数据，组间差异判断采用单因素方差分析，α=0.05。

    2结果

    大鼠Müller细胞在接种后24h内即贴壁，酶消化法纯化后剩下的细胞多数为Müller细胞，原代细胞一般14～20d即可长满，按1∶2比例传代，传代后细胞周期缩短至5～7d，经过2次传代后可获纯度相对较高的Müller细胞。细胞形态主要分为2种：一种胞体较大，不规则片状，折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突的分支少而短；另一种胞体较小，蜘蛛状，折光性强，胞突多而长。Müller细胞进行GFAP抗体染色，显示绿色荧光为阳性表达（图1）。纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。

    图 1 培养的第三代Müller细胞GFAP（IF×400）

    2.1缺氧对Müller细胞的影响 倒置显微镜下，Müller细胞在缺氧条件下随时间延长而呈现不同的形态学变化。缺氧4h时细胞形态无明显改变。缺氧8h时，细胞胞体开始变大，突起变粗（图2A），GFAP染色增强；缺氧12h时，细胞肿胀变形，胞内细胞器变大，可见细胞脱落（图2B）；缺氧16h以上，细胞增生能力明显减弱，细胞凋亡指数明显增加（表1），细胞脱落增多，但大部分细胞仍然存活，缺氧16h内细胞存活率在83%以上(台盼兰测定)。常氧条件下，VEGF，Flk-1和Flt-1表达很少，缺氧24h以内可见VEGF，Flk-1，Flt-1表达明显增加，Flt-1较Flk-1表达量多，阳性细胞的胞浆和突起中可见有粗大的棕黄色颗粒（图3，4）。24h内随缺氧时间延长，VEGF表达持续增加，而Flk-1，Flt-1表达比较平稳，变化不明显（表1）。缺氧16h前，Flk-1，Flt-1表达量持续上升，Flt-1表达量约为Flk-1的2～3倍；缺氧16 h后两者表达量趋向平稳。

    图 2 缺氧的Müller细胞（×200） A:8h, B:12h

    图 3 缺氧16 h Müller细胞Flt-1表达（SABC×400）

    图 4 缺氧20h Müller细胞Flk-1表达（SABC×400）

    2.2 VEGF对Müller细胞的影响 细胞在缺氧前24h时加入不同浓度的VEGF后，终浓度为50，75，100μg/L的VEGF对细胞有明显作用，细胞增生，凋亡减少，作用呈剂量依赖性（表2）。细胞凋亡表现为：核固缩、染棕黄色、着色不均匀，典型的呈指环状（图5）。添加75μg/L VEGF 24h后再经不同时间缺氧，细胞数增多，活性增强了1.3倍，凋亡指数下降到2/3(表3)。

    图 5 Müller细胞(TUNEL×400)

    2.3 VEGF受体阻断剂SU1498对Müller细胞的作用 在缺氧前24h时加入75μg/L VEGF和700μg/L SU1498，缺氧24 h与VEGF组相比，细胞增生活性降低，凋亡指数升高，而与对照组相比，结果也有明显的显著性，说明SU1498部分抑制了VEGF对缺氧Müller细胞的作用（表4）。

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