3讨论

    我们成功分离培养大鼠Müller细胞并建立细胞缺氧损伤模型，观察了缺氧对Müller细胞的影响，以及VEGF对Müller细胞的保护作用，并对其机制进行了初步分析。正常情况下，Müller细胞很少表达GFAP，VEGF及其受体（如Flk-1，Flt-1），短时间缺氧能够使Müller细胞GFAP，VEGF及其受体的表达显著升高，细胞形态变化，甚至发生凋亡，这种影响呈时相依赖性。缺氧12 h时Müller细胞的损伤最明显，细胞肿胀，活性降低，凋亡指数升高。其机制可能有：（1）缺氧使Müller细胞胞外K+浓度升高，导致细胞去极化及提高其代谢率；（2）缺氧导致无氧代谢增加，产生大量乳酸；（3）缺氧导致细胞内花生四烯酸水平升高[12]，引起细胞肿胀；（4）更重要的是，Müller细胞内的Ca2+超负荷，它可对继发的Müller细胞增生提供信号[13]，促进cyclin D1的合成表达，从而诱导细胞增生[14]。我们在缺氧处理前加入终浓度为10～100μg/L的外源性VEGF，与单独缺氧组比较，细胞活性升高，凋亡指数下降，提示外源性VEGF对Müller细胞抗缺氧损伤具有一定的保护作用。75μg/L和100μg/L VEGF处理组间，细胞活性和凋亡指数差异不明显，说明VEGF对Müller细胞的保护作用在一定范围内（<75μg/L）时呈剂量依赖关系，最大效应剂量可能约为75μg/L，超过75μg/L时，细胞活性并未出现更显著提高，这可能是VEGF受体相对饱和所致。脑组织星形胶质细胞研究发现，常氧下加入10～100μg/L VEGF，GFAP表达增加，细胞增生活性升高，并呈剂量依赖性[15]。加入MEK1抑制剂PD98059和PI-3激酶抑制剂wortmannin抑制了VEGF诱导的脑胶质细胞GFAP表达[14]，说明正常环境中VEGF对脑胶质细胞的作用机制包含PI3/AKT和ERK/MAPK两条通路。Müller细胞是视网膜中一种特化的星形胶质细胞，具有一般星形胶质细胞的特点，但VEGF对缺氧Müller细胞作用机制是否也通过这两条通路实现，还需要进一步证实。

    血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）是VEGF特异性的膜受体，根据其结构与功能的不同主要分为：Flt-1(fms-like tysosine kinase)，KDR/Flk-1（kinase insert domain containing receptor）及VEGFR-3共3种[16]，Flt-1，Flk-1主要在血管内皮细胞表达，另外，Flk-1还分布在神经细胞、单核细胞和滋养层细胞等处。Khaibullina等[17]认为，Flk-1参与血管形成[18]、神经营养和神经保护过程[19]，而Flt-1明确的作用至今还不清楚，有人认为与胶质细胞有关[20]。Mani等[15]研究证实，用Flk-1和Flt-1的反义寡核苷酸发现VEGF对脑胶质细胞起保护作用的主要受体是Flt-1而非Flk-1，而且在外源性VEGF为25μg/L时，细胞的增生活性即明显增加，VEGF为100μg/L时，细胞增生活性最高，凋亡指数最低。本实验中，加入Flk-1阻断剂SU1498后，VEGF对细胞的缺氧保护作用受到抑制，说明Flk-1参与了此过程，VEGF可能是一种细胞受缺氧应激因素影响下的保护因子。Flk-1，Flt-1随缺氧时间表达量增加，并呈剂量依赖性，以Flt-1最为明显，说明Flk-1，Flt-1都参与了 VEGF对缺氧Müller细胞的作用，以Flt-1更为重要。本实验所得量效关系与上述报道有所不同，可能与细胞种类、处理因素及VEGF的来源不同有关。

    总之，Müller细胞是视网膜中重要的神经细胞之一，发挥重要的视觉功能，研究缺氧条件下VEGF对Müller细胞的作用及其机制，可以有助于另一个侧面研究缺氧和辅助VEGF对于视网膜中多种细胞的影响，有助于各种视网膜细胞功能损伤的机制探索，为缺血性视网膜疾病的治疗提供新的思路。

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