【摘要】  目的：探讨层黏连蛋白对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响。方法：体外培养的第3代翼状胬肉成纤维细胞，接种于层黏连蛋白包被培养皿（Ln组）和空白培养皿（对照组）中，倒置显微镜观察细胞生长状态，MTT法检测细胞增殖状态，作出生长曲线；免疫荧光法检测α-SMA在细胞内的表达；RT-PCR法检测TGF-β1和cytokeratin mRNA的表达水平。结果：Ln组成纤维细胞数量少于对照组；3~7d，Ln组A570明显低于对照组（0.20 vs 0.28，0.22 vs 0.30，0.28 vs 0.34，0.31 vs 0.36，0.33 vs 0.36，P <0.05）；α -SMA在对照组细胞内表达良好，在Ln组的表达受到抑制；与对照组相比，Ln组TGF-β1 mRNA的表达下降，cytokeratin mRNA表达增加。 结论：层黏连蛋白能抑制翼状胬肉中成纤维细胞的增殖。

   【关键词】  层黏连蛋白；翼状胬肉；成纤维细胞

    The inhibition effects of laminin on human pterygium fibroblasts

    Xin-Ling Wang1, Tao Yu2, Guo-Gang Zhang3, Qi-Chang Yan1, Jin-Song Zhang1

    Foundation items: The 33th Science Fund Projection for Post-Doctor of the State Council (No.2003033282);Senior School Science Research Projection of Education Office of Liaoning Province of China (No.2004C041 and No.05L576);Natural Science Foundation of Scientific Office of Liaoning Province of China (No.20062091)

    1Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110005, Liaoning Province, China;2 Department of Radiology, Liaoning Cancer Hospital, Shenyang 110042, Liaoning Province, China; 3School of Traditional Chinese Medical, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

     Abstract AIM: To observe the effects of laminin on pterygium fibroblasts proliferation in vitro. METHODS: The third passage subcultured pterygium fibroblasts were seeded in laminin-coated plates (Ln group) and blank plates (Control group). The pterygium fibroblasts growth was observed with inverse microscopy and the images were recorded with digital camera. The cells proliferation was detected with MTT assay and the growth curve were made to show the difference trend (0.20 vs. 0.28, 0.22 vs. 0.30, 0.28 vs. 0.34, 0.31 vs. 0.36, 0.33 vs 0.36, P <0.05). Positive expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) was recorded with immunofluorescent microscopy. The mRNA level of TGF-β1 and cytokeratin were detected with reverse transcriptase-polymerase chin reaction (RT-PCR). RESULTS: There were fewer cells on plates in Ln group than in control group. OD570 values were significantly lower during the 3-7 day in Ln group than the control group. The positive expressions of α-SMA were inhibited in Ln group, while they were quite well in the control group. The mRNA level of TGF-β1 decreased and that of cytokeratin increased in Ln group.

    · CONCLUSION: Laminin can inhibit the proliferation of pterygium fibroblasts.

    · KEYWORDS: laminin; pterygium; fibroblasts

    王欣玲,于韬,张国刚,阎启昌,张劲松. 层黏连蛋白对人翼状胬肉成纤维细胞生长的抑制作用.国际眼科杂志,2007;7(3):645-647

    0引言

    原发性翼状胬肉术后复发一直是一个眼科难题，复发率高达20%~40%，处理不当，容易再次复发。翼状胬肉复发的诱因是手术创伤及术后炎症反应，使胬肉组织残留的成纤维细胞和血管细胞活化，以及细胞外基质蛋白的沉积，导致纤维血管组织形成[1]。目前的治疗多采用羊膜移植或联合角膜缘干细胞移植，抑制炎症和新生血管，抑制纤维化，减少疤痕形成，阻止翼状胬肉切除后的复发疤痕化。层黏连蛋白作为基底膜和羊膜的主要成分，其促进上皮细胞生长的特性，已经在多种细胞得到证实。我们探讨层黏连蛋白对于复发性翼状胬肉中成纤维细胞生长的影响，为羊膜移植的临床研究提供分子生物学实验资料。

    1材料和方法

    1.1材料 IMEM和胎牛血清购自美国Hyclone公司，层黏连蛋白、含异硫氰酸胍的总RNA提取试剂TRIzol试剂和莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, M-MLV）反转录酶购自美国Gibco公司，抗α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）pAb，异硫氰基荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗小鼠IgG和四甲基异硫氰基若丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC）标记的羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司。Taq DNA聚合酶购自Takara公司。使用Olympus BX51型荧光显微镜、Olympus CK40型倒置显微镜、Eppendorf TC-96 型聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、Pharmacia EPS301型电泳仪、BioRad Gel Doc2000型凝胶成像仪和图像分析系统。

    1.2方法 以30mg/L层黏连蛋白包被6孔（每孔1 000μL）和96孔（每孔100μL）培养皿，4℃过夜，IMEM漂洗3次后，于超净台内晾干备用。取复发性翼状胬肉患者手术中切除的纤维性增生组织约1mm×2mm×2mm大小，组织块法原代培养在含100mL/L胎牛血清的IMEM培养基中，待细胞长到70%~80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，第3代细胞用于实验。按照培养皿的不同分为层黏连蛋白包被组（Ln组）和普通培养皿组（对照组）。细胞经胰酶消化后制成5×107/L的单细胞悬液，在Ln组和对照组各取7个96孔板，每板分别接种细胞20孔，50mL/L CO2恒温培养箱中培养。培养后第1~7d上午10∶00点各取1板，每孔加入5g/L四甲基偶氮唑盐（MTT）20μL，孵育4h后弃去上清，每孔加入二甲亚砜(DMSO) 150 μL，常温下15min后测定各孔在570nm的吸光度值(A 570)，做出生长曲线。细胞接种于6孔培养皿72h后，40g/L多聚甲醛固定30min， 5mL/L聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）100漂洗3次，100g/L的BSA封闭过夜。分别加入1∶100(体积比)稀释一抗（α-SMA），37℃恒温孵育1h，1∶100(体积比)稀释二抗（山羊抗家兔IgG-TRITC），37℃恒温孵育40min，PBS漂洗终止反应，封片，荧光显微镜观察并拍照，记录整合素β1和PCNA的表达情况。应用TRIzol一步法提取总RNA，M-MLV逆转录合成cDNA；引物β-actin（201bp，5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTGT-3′和5′-ACTTCTAGT TCTAGTA ACGAGG-3′），TGF-β1（526bp，5′-CCTGGAAA GGGCTCAACACC-3′和5′-CTGTTGCCAGCAGGTCCGAG -3′），cytokeratin（304bp，5′-CAGACACACGGTGAACTATG G-3′和5′-GATCAGCTTCCACTGT TAGACG-3′）在Taq DNA多聚酶作用下进行扩增；94.5℃预变性2min，94℃持续30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环后延伸7min；10g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像及图像分析系统显影并记录。

    统计学处理：使用计算机SPSS10.0统计软件。两数据组间差异采用方差分析t检验进行统计分析。

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