【摘要】  目的：构建并鉴定含鼠bcl -2基因重组逆转录病毒。 方法：将抗凋亡基因bcl -2片段从载体pcDNA3.1中切下，定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中，酶切鉴定；脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67，G418筛选建立稳定表达bcl -2的细胞株。 结果：双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl -2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论：含抗凋亡基因bcl -2重组逆转录病毒载体构建成功。

   【关键词】  逆转录病毒载体 重组 bcl -2基因

     0引言

     随着一些常见致盲眼病已有较好的防治措施，难治性或不可治性眼病已成为眼科研究的热点和焦点。难治性眼病主要是指一些累及视网膜的变性性疾病，如遗传性视网膜变性、老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞（RPE）和锥杆（光感受器）细胞的渐进性变性死亡，迄今尚无防止这些细胞变性死亡的有效方法。我们构建抗凋亡基因bcl -2重组逆转录病毒，将其导入培养的正常的SD大鼠RPE细胞，然后将其显微注射入视网膜色素变性鼠的视网膜下腔，对视网膜变性性疾病基因治疗进行探索性研究，为构建并鉴定bcl -2基因重组逆转录病毒的工作报道如下。

    1材料和方法

    1.1材料  PLNCX2逆转录病毒载体和包装细胞系PT67为第二军医大学微生物教研室潘卫提供，含鼠bcl -2基因的pcDNA3.1（酶切位点（KPnⅠ+XbaⅠ））由中国科学院细胞生化所刘新垣教授惠赠，质粒提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒均购于上海博彩生物科技有限公司；TOP10F’和DH5α大肠杆菌菌株由微生物教研室提供，以CaCl2方法制成感受态细胞；各种限制性内切酶及pMD18T载体购于TaKaRa宝生工程（大连有限公司）；NIH3T3细胞、脂质体及G418均购自Clontech公司；琼脂糖及各种生化制剂购于上海华舜生物工程公司产品。

    1.2方法  ①pcDNA3.1（bcl -2）的扩增：将小鼠pcDNA3.1（bcl -2）质粒用CaCL2方法转入大肠杆菌TOP10F′菌株中，LB培养基扩增，碱裂解法提取质粒DNA，并用Wizard质粒提取试剂盒加以纯化质粒DNA。②设计和合成引物（带有Hind  Ⅲ和StuⅠ两酶酶切位点），上游5′-ATA AAG CTT ATG GCG CAA GCC GGG AGA-3′（含HindⅢ酶切位点），下游5′-TAT AGG CCT TCA CTT GTG GCC CAG GTA-3′（含StuⅠ酶切位点），由上海生工生物工程公司合成。（3）PCR扩增：50μL体系中，模板DNA1μL，dNTP1μL（200μmol/L），引物上游5′-ATA AAG CTT ATG GCG CAA GCC GGG AGA-3′（含Hind Ⅲ酶切位点），下游5′-TAT AGG CCT TCA CTT GTG GCC CAG GTA-3′各1μL（25pmol），Taq Buffer5μL，Taq酶1μL，在PCR仪(2400型，美国PE公司)扩增，94℃5min后94℃30s，55℃30s，72℃50s，35循环，72℃7min，4℃10min。扩增PCR产物序列分析  扩增得到的DNA电泳，低融点胶回收纯化。按Promega操作手册连接插入pGEM-T载体后转化到感受器DH5α大肠杆菌中，筛选出含有bcl -2目的基因质粒的菌落，提取酶切鉴定后，命名为pGEM-bcl -2。将所选出含有目的基因质粒的大肠杆菌送上海基康公司进行测序。用限制性内切酶Hind Ⅲ和StuⅠ酶解质粒pGEM-bcl -2，电泳、低融点胶回收小鼠bcl-2 DNA片段（0.7kb），溶解于TE中，-20℃保存。逆转录病毒载体PLNCX2，用限制性内切酶Hind Ⅲ和StuⅠ酶切后去磷酸化，pGEM-bcl -2经同样酶切后分离出0.7bpbcl-2全部编码区片段，在T4DNA连接酶的作用下与载体连接、转化，以及用快筛法筛选出基因重组子PLNCX2－bcl -2。转染包装细胞系PT67 复苏包装细胞系PT67，在完全培养基（含小牛血清）培养中，在转染前12～24h，将PT67细胞系接种于60mm的培养皿中，当细胞生长至60％～80％融合时，加入预先准备好的转染混合液于37℃，CO2孵育箱中培养24h，其中包括重组逆转录病毒载体质粒100μL和空载体100μL（均为质粒5μg，脂质体30μg，用无血清培养液稀释而成）；次日更换新鲜的完全培养基，于转染72h后，吸出培养基，PBS洗涤细胞2次后重新加入5mL完全培养基，继续培养48h，以提高病毒滴度。将转染后的包装细胞按照1∶20的比例传代于含G418（300）的选择培养基培养3d，更换为G418（400g/L）培养基维持筛选，继续培养2wk，待长出抗性克隆后分选大而健康的克隆并转移至另外的培养板各孔中，加入不含抗生素的培养基扩大培养；病毒作相应稀释后感染NIH3T3细胞，测定病毒滴度。

    2结果

     测序与Gene bank一致，证明PCR成功扩增带有Hind Ⅲ和StuⅠ两酶酶切位点的目的基因（图1，2）。PLNCX2－bcl -2重组的表达载体的酶切鉴定见图3。当包装细胞生长至60％～80％融合时，加入转染混合液，约数分钟后可发现许多微小的白色颗粒附着在细胞表面，约4～6h后白色颗粒逐渐进入细胞内部。当细胞培养在含G418的选择培养基时，可见细胞大量死亡，随着时间的推移，活着的细胞即为成功转染的细胞，渐有克隆形成。扩增后测定的最大病毒滴度为3×1011cfu/L。

    3讨论

     细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀（suicide）。因此凋亡由基因控制，故又有人称这种细胞死亡为编程性（程序性）细胞死亡（programmed cell death，PCD）。现有资料表明，无论在生理还是在病理状态下的PCD，bcl -2基因都是关键的调控因素，bcl -2基因首先被发现位于第14号和第18号染色体平衡异位部位，并存在于大多数人类滤泡细胞淋巴瘤中[1]。bcl -2是B细胞淋巴瘤或白血病-2基因（B-cell lymphoma/ leukemia-2）英文首字母缩写。该基因于1985年首先在大多数非霍奇金淋巴瘤（non-Hondgkin B-cell lymphomas）细胞染色体上因易位而激活的基因中发现。1990年揭示该基因有特殊的抑制PCD的作用。bcl -2有如此好的抑制细胞凋亡的作用，那我们对于那些以细胞凋亡为病理机制的神经变性性疾病就有可能寻找到了一条出路，当然我们需要寻找有效而安全的“运输工具”将之导入细胞才能使之发挥作用。目前一直在研究的病毒性载体，有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等。Bennett等[2]用腺病毒将bcl-2基因导入小鼠，发现bcl -2可使其感光细胞变性明显减慢且延迟到小鼠出生后6wk才发生。逆转录病毒作为基因导入细胞的运载工具，应用最早，研究也相当成熟，而且目前仍被广泛应用。国内已报道成功构建反义人bcl -2基因逆转录病毒表达载体[3,4]，还有报道成功构建具有完整bcl -2表达区的重组表达载体，以及带有bcl -2阅读框架起始部位的部分编码区正反向逆转录病毒重组表达载体[5]。本文成功构建PLNCX2-bcl -2重组表达载体。为后期的视网膜色素变性的研究实验奠定了一定的理论基础和数据参考。

   【参考文献】

1任新尧,罗超权.分子遗传学与基因工程.第1版.北京:科学出版社,1999:346-347

2 Bennett J, Zeng Y, Bajwa R, Klatt L, Li Y, Maguire AM. Adenovirus-mediated delivery of rhodopsin-promoted bcl-2 results in a delay in photoreceptor cell death in the rd/rd mouse. Gene Ther ,1998;5:1156-1164

3陈协群,工文亮,黄高升,王成济. bcl-2反义RNA对白血病细胞株程序化死亡的调变.中华医学杂志,1996;76(2):112-115

4曹国栋,王申五,陈得喜,马丽萍,潘秀英,林文玉.逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡.中华血液学杂志,1998;19:467-469

5林祥华,陈志哲,杨婷,吕联煌.反义bcl-2基因逆转录病毒表达载体的构建.福建医科大学学报,2001;35(1):1-3