姜德咏 李惠玲
    湖南博雅眼科医院 湘雅二医院眼科

    RIR损伤（retinal ischemia-reperfusion injury，RIR）包括血和再灌注2次损伤，是眼科较为常见的一种病理过程，可发生于高血压、视网膜血管阻塞性疾病以及部分影响视网膜血流的内眼手术等。严重者可诱发视网膜神经细胞凋亡，导致不可逆性的视功能丧失。

    越来越多研究表明，细胞凋亡与细胞器的功能障碍密切相关，这些细胞包括线粒体、内质网、高尔基体和溶酶体等。近年研究发现，内质网比其他细胞器更容易、更早受累，内质网相关凋亡途径的下游多数与线粒体等细胞器有关。因此，内质网作为细胞凋亡新的、更早的始动靶点，受到极大重视。

    内质网（ER）是一种具有重要生理功能的细胞器。它既是细胞的Ca2＋ 贮存器，也是多肽链折叠与装配、蛋白质合成与翻译后修饰的重要场所。缺氧、氧化应激、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、NO等均可使内质网的生理功能发生紊乱，导致蛋白质折叠等功能障碍，诱发内质网应激-ERS（endoplasmic reticulum stress，ERS）。发生ERS的细胞要么适应，要么损伤或凋亡，我们推测RIR损伤过程中存在ERS，但RIR与ERS的关系迄今未见研究报道。

    由于ERS常导致内质网内未折叠蛋白质或错误折叠蛋白的蓄积，引起未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），所以一般用参与UPR的标志性分子来提示ERS的发生。在非ERS条件下，免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin-binding protein，BiP）能结合这三个分子的内质网内端，维持信号转导因子的非活化状态。UPR时，激活的核酸内切酶Ire1α能从X盒结合蛋白1（X box-binding protein-1，XBP-1）mRNA中特异性剪切26个碱基的内含子，改变XBP-1 mRNA的开放阅读框，其翻译产物XBP-1能促进含ERS反应元件（endoplasmic reticulum stress responsive element，ERSE）的UPR靶分子如BiP/GRP78表达，以减轻或中止ERS反应，从而恢复细胞内环境稳态。可见BiP是ERS的关键性调控分子，其中BiP和XBP-1表达上调常被用作ERS的标志。大量研究表明：发生ERS的细胞能调节ERS相关性促凋亡分子如CHOP和caspase-12等和促存活分子如GADD34和BiP等的表达/活化，最终决定细胞是适应还是凋亡。

    本研究拟采用前房高压灌注法建立大鼠RIP模型，探讨 ① RIR损伤对视网膜ERS标志分子BiP和XBP-1表达的影响；② 玻璃体腔内注射BiP反义寡核苷酸对RIR损伤致细胞凋亡的影响；③ RIR和BiP反义寡核苷酸对促凋亡分子CHOP和促存活分子GADD34转录的影响，以期揭示RIR损伤致细胞凋亡的ERS机制。

    本研究在成功建立大鼠RIR模型基础之上进行了：① RIR损伤对视网膜ERS标志分子BiP和XBP-1表达的影响；② BiP反义寡核苷酸对再灌注损伤中细胞凋亡的影响；③ RIR和BiP反义寡核苷酸对促凋亡分子CHOP和促存活分子GADD34转录的影响。

    结果显示：① 大鼠RIR模型及视网膜细胞凋亡情况：Ⅰ. 可以清楚观察到模型动物发生视网膜缺血-血液复流征象，RIR后视网膜内丛状层可发生水肿、空泡、核固缩和萎缩等改变。Ⅱ. TUNEL阳性细胞主要位于视网膜神经节细胞层和内核层，外核层均未见明显TUNEL阳性细胞。对照组视网膜在各时间点偶见TUNEL阳性细胞；与对照组相比较，RIR组再灌注后6h、12h、24h和72h视网膜TUNEL阳性细胞显著性增多（P＜0.01）。在RIR组中，视网膜TUNEL阳性细胞6h开始增加，24h达到高峰（P＜0.01），72h时明显减少，而7d后TUNEL阳性细胞极少见。

    ② RIR损伤对视网膜BiP和XBP-1表达的影响：Ⅰ. 与对照组相比较，RIR组BiPmRNA的表达在再灌注后3h、6h、12h和24h均显著增加（P＜0.01＝。在RIR组中，BiPmRNA的表达在再灌注后3h增加，到6h达到高峰（P＜0.01＝，12h和24h持续表达增加，但较6h有下降（P＜0.01＝，72h接近正常水平（P＞0.05）。Ⅱ. 在RIR组，BiP免疫反应阳性细胞主要表达在视网膜节细胞层和内核层，BiP蛋白于12h表达明显增加，24h达到高峰（P＜0.01），72h开始减少；对照组大鼠视网膜节细胞层中有少量BiP免疫反应弱阳性细胞。Ⅲ.在RIR组，XBP-1免疫反应阳性细胞仅见于视网膜神经节细胞层和内核层，其表达于12h开始明显增加，24h达到高峰（P＜0.01），72h有所下降；对照组大鼠视网膜中未见XBP-1免疫反应阳性细胞。

    ③玻璃体腔内注射BiP反义寡核苷酸对再灌注损伤中细胞凋亡的影响：Ⅰ. 玻璃体腔内注射200?mol/L FAM标记的BiP反义寡核苷酸：2h后视网膜神经节细胞层可见到较强荧光强度的阳性细胞，4h后荧光阳性细胞数增加，但12h后大部分荧光减退。Ⅱ. 再灌注后12h和24h，反义组视网膜BiP蛋白的表达量明显低于错义组和RIR组（P＜0.01）；Ⅲ.与BiP错义组和RIR组相比，BiP反义组再灌注后12 h和24 h视网膜组织中TUNEL阳性细胞数明显增加（P＜0.05），而BiP错义组与RIR组之间没有明显差别。Ⅳ.再灌注7d后，BiP反义组视网膜内丛状层可见较多炎性细胞浸润，视网膜结构的破坏较BiP错义组严重，而BiP错义组与RIR组之间没有明显差别。

    ④RIR和BiP反义寡核苷酸对GHOP和GADD34转录的影响：Ⅰ.与对照组相比，RIR组大鼠RIR后3 h、6 h、12 h、24 hCHOPmRNA的表达显著增加（P＜0.01）。在RIR组内，再灌注后3 hCHOPmRNA的表达明显增加并接近峰值，6 h达到高峰（P＜0.01），12 h仍持续性高表达，24 h后开始下降（P＜0.05），72h接近对照组水平。在各观察时间点，错义组CHOPmRNA的表达水平与RIR组没有明显差异（P＞0.05）。在反义组内，3 hCHOPmRNA迅速接近高峰，6 h和12 h持续高峰表达，24 h和72 h略有下降（P＜0.05），但反义组RIR后24h和72h时CHOPmRNA的表达量明显高于RIR组和对照组（P＜0.01）。Ⅱ.在RIR组内，再灌注后6hGADD34mRNA的表达增加，12 h达到高峰（P＜0.01），24h和72h后有持续表达，但较12h明显下降（P＜0.05）。与对照组相比，RIR组大鼠RIR后6h、12h、24h和72hGADD34mRNA的表达显著增加。在各观察时间点，错义组GADD34mRNA的表达水平与RIR组没有明显差异（P＞0.05）。反义组组内比较，24h和72h时GADD34mRNA的表达量明显增加（P＜0.01）。但RIR后6h、12h和24h反义组GADD34mRNA的表达量明显低于RIR组（P＜0.01＝，而72h时明显高于RIR组（P＜0.05＝。

    结论：

    ①采用提高眼压（110mmHg×60min）的方法能成功建立伴有视网膜细胞凋亡的RIR损伤模型。

    ②RIR损伤能触发ERS的发生，ERS是RIR损伤致细胞凋亡的重要机制。

    ③BiP在RIR损伤中起保护性作用。

    ④在RIR损伤中，随着ERS加重，促凋亡分子CHOP迅速持续表达，而促存活分子GADD34延迟表达，这可能是ERS致细胞凋亡的重要机制。

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