朱洁 王雨生 张鹏 张自峰

第四军医大学西京医院眼科 全军眼科研究所 陕西省西安市 710032

目的 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受缺氧调节的特性使其成为最重要的促新生血管形成因子，参与缺氧诱导的眼内新生血管形成。但缺氧上调视网膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)细胞VEGF表达的信号转导机制尚不完全清楚。缺氧诱导因子1(hypoxia inducible fac tor 1，HIF-1)是缺氧反应中一个重要的基因转录调节因子，调控缺氧诱导的VEGF的表达。Ca2＋作为一种信使分子，广泛参与细胞信息传递、分泌、细胞增生及分化等一系列与生命现象密切相关的过程，同时也参与了细胞对缺氧的应答。本研究运用钙离子载体A23187及胞内Ca2＋螯合剂BAPTA-AM探讨Ca2 ＋信号转导通路在缺氧诱导RPE细胞表达HIF-1α和VEGF中的作用。

方法 200μM氯化钴(Cobalt Chloride，CoCl2)建立培养人RPE细胞化学缺氧模型。将5μM的Ca2＋载体A23187及10μM的胞内Ca2＋螯合剂BAPTA-AM分别作用人RPE细胞，在常氧及缺氧状态下培养。于15min、30min、1h、 2h，激光共聚焦显微镜观察并记录RPE细胞[Ca2+]i变化。于0.5、1、2、4、6、8、16和24h，原位杂交、免疫荧光、免疫细胞化学法检测RPE细胞内HIF-1α mRNA 及蛋白的表达；于0.5、1、2、4、6、8、16和24h，ELISA法检测RPE细胞培养上清内VEGF含量的变化，t检验比较各组之间的差别。

结果 缺氧及Ca2＋载体A23187均可使RPE细胞[Ca2+]i迅速升高，胞内Ca2＋螯合剂BAPTA-AM 可以抑制缺氧状态下RPE细胞[Ca2+]i的升高。缺氧及Ca2＋载体A23187均可诱导RPE细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达，胞内Ca2＋螯合剂BAPTA-AM可抑制缺氧诱导的RPE细胞HIF-1活化。缺氧和Ca2＋载体A23187可显著上调RPE细胞VEGF的表达，胞内Ca2＋螯合剂BAPTA-AM可抑制缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达。

结论 RPE细胞内HIF-1α mRNA及蛋白的表达受缺氧调控，活化的HIF-1转录激活VEGF的表达。A23187作用于RPE 后，出现类似于细胞缺氧诱导的HIF-1α转录激活、HIF-1α的核转位、HIF-1的靶基因VEGF表达升高等一系列变化。BAPTA-AM预处理RPE，可以显著抑制缺氧导致的HIF-1活化和VEGF的高表达。证实了Ca2+参与了缺氧诱导的人RPE细胞HIF-1活化和分泌产生VEGF蛋白的过程。提示阻断Ca2＋信号转导途径可能抑制缺氧状态下RPE细胞HIF-1的活化和VEGF的表达，为治疗眼内新生血管疾病提供了新的思路。