【摘要】 目的：内皮抑素是一种内源性的血管生成抑制剂。运用定点突变技术对人内皮抑素基因进行改造，将内皮抑素中的RGAD改为RGD序列。构建野生型和突变型RGDendostatin基因的真核表达载体，为进一步探讨其对角膜新生血管的影响奠定基础。方法：以pMD18T/endostatin载体为模板扩增野生型内皮抑素基因全长编码序列，克隆至真核表达载体pIRES2EGFP上，采用快速体外定点诱变技术获得RGD突变体。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果：PCR成功扩增了野生型和RGD突变型的内皮抑素基因，并成功构建了其真核表达载体。结论：改造的含有RGD结构的内皮抑素基因真核表达质粒的成功构建并鉴定。
【关键词】 内皮抑素；定点诱变；角膜新生血管
Construction of a sitedirected mutant of endostatin
XiuLi Yin, ChunMei Zhang, JingXu Zhang, AnAn Fu, Wei Shang, Ping Liu, HongYan Ge
1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical Universtiy, Harbin 150001, Heilongjiang Province,China；
2Department of Ophthalmology, Longnan Hospital of Daqing, Daqing 163001, Heilongjiang Province, China
AbstractAIM: To construct the eukaryotic express vector of wild type and RGD mutated endostatin gene, and to determine the effects of overexpression of RGD mutated endostatin in corneal neovasculization.METHODS: The full coding domain sequence of endostatin gene was cloned from pMD18T/endostatin vector and inserted into pIRES2EGFP vector. Mutagenesis of RGDendostatin was performed in rapid sitedirected mutagenesis technique in the expression vector pIRES2EGFP. Then, the reconstructed plasmid was identified with PCR, enzyme digestion and sequencing.RESULTS: Wild type and mutated endostatin gene were successfully amplified by PCR and its eukaryotic expression plasmid was constructed.CONCLUSION: The successive reconstruction and verifying of eukaryotic expressive plasmid containing human wild type and mutated endostatin gene establish the foundation of studying of the mechanisms of corneal neovasculization.
KEYWORDS: endostatin; sitedirected mutagenesis; corneal neovasculization
0引言
内皮抑素（endostatin）是近几年发现的一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂。研究发现，内皮抑素能特异性地抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞，并伴有诱导细胞凋亡的作用[1]。近年来，国内外学者对内皮抑素的研究主要集中在它对肿瘤的治疗作用[2]，而在其它血管增生相关性疾病的研究较少。角膜新生血管化（corneal neovascularization,CNV）是临床上致盲的主要原因之一，也是角膜移植排斥反应发生的高危因素[3]，但目前尚无特效的治疗方法。本实验通过将endostatin基因构建至pIRES2EGFP/endostatin质粒上，应用快速定点诱变PCR技术获得RGD突变体，为进一步探讨其对人角膜新生血管抑制作用的研究奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
pMD18T/BIGH3载体、pIRES2EGFP载体和感受态大肠杆菌JM109由本实验室保存。ExTaq DNA Polymerase,限制性内切酶(EcoRI和Sal I)，DNA marker均为Takara公司产品；DpnI酶、T4连接酶购自New England Biolabs 公司; pfu DNA polymerase购自 promega公司; Tryptone， Yeast Extract购自 Oxid 公司产品；卡那霉素、 IPTG和XGal购自哈尔滨宏博生物有限公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华瞬公司。
1.2方法
1.2.1引物设计
根据GeneBank上报道的人endostain 序列,利用软件Oligo primer 5辅助设计克隆endostatin 基因的上、下游引物，由上海英俊生物有限公司合成。上游引物 F：5ATAGCCAGCGAATTCATGCACAGCCAC3,下游引物 5ATTGTCGACCTACTTGGAGGC3,分别为引入的EcoRI和Sal I 酶切位点,上游还增添了强表达的GCCAGC序列。设计诱变RGD的背对背引物：TF:5GGCATGCGG GGCATCCGCGGGGACTTCCAGTGC3；TR；5GCACTGGA AGTCCCCGCGGATGCCCCGCATGCC3。
1.2.2 pIRES2EGFP/endostatin真核表达载体的构建
PCR扩增人endostatin基因的编码框，过程如前所述[4],产物为约550bp，回收上述扩增产物,按产品说明书操作。限制性内切酶EcoRI/Sal I 进行双酶切endostatin基因和pIRES2EGFP载体，胶回收后通过T4连接酶进行连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有卡那霉素、IPTG和XGal LB平板，分别挑取蓝白斑,涂布含有卡那霉素的LB平板,提取质粒分别用双酶切和基因测序鉴定所筛选的阳性克隆，得到pIRES2EGFP与endostatin重组体。
1.2.3快速定点诱变PCR及乙醇沉淀反应
建立以pIRES2EGFP /endostatin为模板的定点诱变PCR反应体系，反应体系为25μL。其中模板0.05μL，25 mmol/L dNTP 1.5μL，上、下游突变引物各0.5μL，3U/μL Pfu高保真酶0.5μL，10×pfuBuffer 2.55μL。反应条件为预变性为95℃ 5min,94℃ 1min，56℃ 60s，72℃ 5min，15个循环，72℃延伸10min。将25μL的定点诱变PCR产物移至1.5mL离心管中，并加入25μL ddH2O补充体积至50μL。加入5μL的3mol/L CH3COONA(Ph 5.2),加入125μL的20℃预冷无水乙醇，充分混匀，过夜。次日，4℃，12000rpm×10min离心，回收沉淀。加入125μL的20℃预冷950mL/L乙醇，充分混匀，4℃，12000rpm×10min离心，回收沉淀。加入250μL的20℃预冷700mL/L乙醇，充分混匀清洗沉淀，4℃，12000rpm×10min离心，小心弃上清后室温干燥[5]。
1.2.4 DnpI酶消化及endostatin突变子克隆载体的构建与鉴定
在上述乙醇沉淀后的离心管内加入Dnp I酶1μL，10×NEB Buffer 2μL，加入ddH2O补充体系至20μL。37℃，水浴2h。取Dnp I消化产物10μL转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含卡那霉素、IPTG和XGal LB平板，37℃，孵化温箱12～16h,挑取单个蓝斑菌落接种于LB培养液中,37℃，200rpm振荡培养10～12h,精提质粒，按Invitrogen公司产品说明书操作。提取质粒分别用双酶切和基因测序鉴定所筛选的阳性克隆。
2结果
2.1真核表达载体的双酶切及PCR鉴定
RGDendostatinpIRES2EGFP 和endostatinpIRES2EGFP真核表达载体分别用EcoRI和Sal I双酶切，可获得两个片段，小片段与endostatin PCR产物相对分子量（Mr）相等，大片段与pIRES2EGFP 空质粒双酶切片段相等，提示重组成功（图1）。
2.2真核表达载体的序列测定
重组真核表达质粒endostatin/ RGDendostatinpIRES2EGFP 测序结果提交GeneBank进行Blast比对，证实了所克隆人的endostatin片段正确,且目的片断准确的插入到pIRES2EGFP载体中的用EcoR I和Sal I多克隆位点中（测序结果略）;同时也证实了第30氨基酸密码预期位点已经发生突变，碱基GCC已经去掉（图2）（上海英俊生物技术有限公司，CB070 417003）。
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