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3讨论
正常角膜处于无血管的透明状态，这种状态对维持眼正常视功能十分重要。角膜缘具有丰富的血管网，在感染、炎症、外伤或角膜手术后，毛细血管由角膜缘处向角膜内生长，称为角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）[6]。虽然新生血管对感染清除、伤口愈合等有一定作用，但CNV会破环角膜正常微环境，使眼前节相关免疫赦免偏离消失，是角膜移植排斥反应的高危因素，而且新生血管常因出血渗出及继发纤维化等导致失明[7]。各种病因，如配戴角膜接触镜、角膜创伤、手术、感染等导致的角膜新生血管增生是致盲的重要原因之一，亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素，但在临床上对于CNV的治疗至今还是一个极为棘手的问题。近年来，随着分子生物学研究的进展，许多有希望的抗血管生成药物出现，为CNV的临床防治开辟了新的途径。CNV是由角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成，与血管内皮细胞的增殖密切相关，血管内皮细胞是人体的正常细胞，具有相对的基因稳定性，长期用药不会产生耐药性，因而角膜新生血管性疾病将是应用内皮抑素进行治疗的一个良好适应证。Endostatin最初是由O’Reilly等在小鼠血管内皮瘤中首次发现的一种内源性的血管生成抑制剂，目前主要是用于肿瘤研究[8]。内皮抑素，是通过抑制血管内皮细胞，从而抑制血管生成。研究表明，内皮抑素可以与VEGF互相竞争肝素的结合位点，从而抑制血管新生；内皮抑素也可抑制金属蛋白酶催化活性，从而抑制基底膜降解形成新生血管；内皮抑素还可通过干扰整联蛋白的作用抑制血管的形成，这也是近年来研究的热点[9]。RGD(ArgGlyAsp)序列是二十世纪八十年代初人们在纤连蛋白分子中发现的。后来发现，RGD序列是广泛分在细胞识别系统的基本单元。1987年，Hynes在总结了已发现的RGD受体的α、β亚基及其生物学性质后，将RGD受体统称为整合素（integrin）[10]。Rehn等的实验表明，endostatin通过整合素α5β1，αvβ3结合来抑制内皮细胞与纤维素的结合，从而阻断了整合素与ECM的连接，抑制内皮细胞的粘附[11]。Sudhakar等也发现，ES可以和整合素直接结合。我们通过对ES的184个氨基酸进行序列分析和比对，有趣的是，并没有发现其含有RGD结构，而发现了RGD的相似需类RGAD。因此，我们成功克隆了人endostatin基因编码框，并构建其真核表达载体，通过体外快速定点诱变PCR技术，去除了一个氨基酸，得到RGD序列，并将进一步比较探讨其突变对抑制人角膜新生血管的影响。
至今为止，角膜新生血管仍然是临床中治疗比较棘手的疾病。通过本实验，我们证实了改造的含有RGD结构的内皮抑素，并成功构建其真核表达载体，将进一步与野生型内皮抑素比较其对人角膜新生血管抑制作用的影响奠定理论基础及技术保证,为早期防治角膜新生血管提供了理论依据。
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6廖琼,刘翔.角膜新生血管形成机制研究进展.眼科研究 2004;22(2):213215
7苏凡凡，张明昌.姜黄素对大鼠碱烧伤角膜新生血管的抑制作用.国际眼科杂志2008;8(9):18061808
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10 Ruoslahti E, Pierschbacher MD. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science 1987;238(4826):491497
11 Vnnen A,Ylipalosaari M, Parikka M, et al. Collagen XVIII modulation is altered during progression of oral dysplasia and carcinoma. J Oral
Pathol Med 2007;36(1):3542
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