【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及机制。方法：采用高氧使鼠视网膜血管阻塞建立早产儿视网膜病变模型后，将鼠分为两组，玻璃体腔内注射75μmol/L的GM6001 0.5μL，另一组不治疗。5d后处死，行视网膜HE染色计数矢状面5μm视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数，和血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶2（MMP2）免疫组织化学染色，以及视网膜铺片。同时设立正常对照组。结果：GM6001治疗组视网膜发生新生血管的眼数较高氧对照组少，但较正常对照组多。GM6001治疗组、高氧对照组、正常对照组平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数为2.38±0.90, 21.25±1.12和 1.23±0.46，高氧对照组与正常对照组具有显著统计学差异（P<0.01），GM6001治疗组与正常对照组无统计学差异（P>0.05），与高氧对照组具有显著统计学差异（P<0.01）。视网膜铺片正常对照组血管发育成熟，深浅两层血管网结构清晰，可见螺旋动脉，高氧对照组血管迂曲阻塞，大量结构异常新生血管，丧失了血管网结构，GM6001治疗组见两层血管网结构清晰，仍有少部分深层血管阻塞。视网膜免疫组织化学检测GM6001治疗组VEGF及MMP2与正常对照组有统计学差异（P<0.05），与高氧对照组也有显著统计学差异（P<0.01）。结论：GM6001可抑制视网膜病的血管新生，机制可能是抑制了MMP2对VEGF的作用。
【关键词】 早产儿视网膜病变 视网膜新生血管 基质金属蛋白酶 血管内皮生长因子
视网膜缺血可导致视网膜新生血管化，新生血管的异常增生可引起玻璃体出血、视网膜脱离和新生血管性青光眼等，使患者视力丧失。而目前尚缺乏安全、有效的治疗方法。手术、激光治疗有一定的效果，但存在一定的并发症，寻找和研制有效的抑制眼内新生血管的生物药物是当前眼科以及儿科研究的热点。
1材料和方法
1.1材料
氧浓度测量仪（梅城电化分析仪器厂，CY12C），1.0μL微量进样器（上海安亭微量进样器厂），MMP抑制剂GM6001购自Chemicon，30mL/L过氧乙酸，PBS缓冲液（pH7.2），0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液、一抗小鼠抗大鼠mAb（VEGF购自Santa Cruz，MMP2购自Neomarkers），、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），DAB显色液（上海长岛生物技术有限公司），硝酸铅、硫化铵、顺丁烯二酸、ADP（国药集团化学试剂有限公司），健康7d龄Sprague Dawley（SD）大鼠（上海市第三人民医院实验中心提供）36只，雌雄不限。
1.2方法
将24只7d龄SD大鼠与哺乳母鼠一起置于笼盒中，密闭，进气孔接医用纯氧，出气孔接氧浓度测量仪，先将氧气流量调至5L/min，使氧气迅速充满氧箱，氧浓度达700mL/L后将流量降至1L/min，使浓度缓慢上升至750mL/L，再调低流量至0.5L/min左右维持氧浓度稳定在750±20mL/L范围内。每日开箱，并与正常对照组更换哺乳母鼠，防止大鼠肺损伤。连续吸氧5d。返回空气后分为2组： 75μmol/L GM6001治疗组、高氧对照组，璃体内注射量均为0.5μL。注药5d后3g/L戊巴比妥纳麻醉后每组随机选取两只鼠行视网膜铺片，摘除双眼。至中性甲醛中固定48h，去除眼前节，桔瓣样将眼杯平分成4份，分离出视网膜。ADP酶染色：用0.05mol/L PH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min 5次，之后加入37℃新鲜配置的反应液中孵育15min（0.2mol/L PH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液中含硝酸铅3mmol/L、氯化镁6mmol/L、ADP 1g/L），0.05mol/L pH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min 5次，用100g/L硫化铵反应1min，0.05mol/L PH7.2的TRIS顺丁烯二酸缓冲液漂洗15min 5次，视网膜铺片，显微镜下观察结果。余10只鼠均摘除左眼眼球中性甲醛中固定48h，去除眼前节，常规石蜡包埋，矢状面平行视神经切片后6μm，每隔30μm取1张，共取10张。计数每张切片突破内界膜的内皮细胞核数，10张之均数做为一个标本。每只眼球随机取两张切片，作VEGF、MMP2免疫组织化学染色。拍照后用Image pro plus6.0行图像分析，测量阳性表达部位的累积吸光度值。同时设立正常对照组12只。表1 大鼠视网膜VEGF和MMP2表达（略）
统计学处理：数据经SAS612行统计学分析，所有数据以±s表示，行方差齐性检验和t检验及相关分析。
2结果
2.1视网膜组织学改变
GM6001治疗组视网膜发生新生血管的眼数较高氧对照组少，但较正常对照组多。GM6001治疗组、高氧对照组、正常对照组平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数为2.38±0.90, 21.25±1.12和1.23±0.46，高氧对照组与正常对照组具有显著统计学差异（P=0.00），GM6001治疗组与正常对照组无统计学差异（P=0.467），GM6001治疗组与高氧对照组具有显著统计学差异（P=0.00，图1）。正常对照组生后17d时视网膜血管基本成熟，全部视网膜血管分深浅两层，浅层血管自视盘向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜走行的弓形血管。深层血管呈多角形网状形态，两层血管通过螺旋形的交通动脉互相连接。高氧对照组在生后17d时自视盘发出的视网膜血管扩张迂曲，有大量新生血管形成，血管密度明显增高，且这些新生血管网结构及分布及其紊乱，丧失了正常的两层血管网结构，且广泛闭塞。GM6001治疗组显示两层血管网结构清晰，形态基本正常，大血管向四周放射状均匀分布，小血管轻度阻塞（图2）。
2.2视网膜VEGF和MMP2的表达（图3）
正常17d龄大鼠VEGF呈弱阳性表达，主要定位于内核层和神经纤维层，高氧组呈强阳性表达，各层均有表达，以神经纤维层，内界膜层以及突破内界膜的血管内皮细胞为主，治疗组各层均匀表达，呈现弱阳性。GM6001治疗组VEGF表达与正常对照组有统计学差异（P<0.05），GM6001治疗组与高氧对照组具有显著统计学差异（P<0.01）。正常17d龄大鼠MMP2在视网膜各层呈弱阳性表达，以色素上皮细胞层、神经纤维层及神经节细胞层为主，高氧组在视网膜各层呈强阳性表达，治疗后呈弱阳性表达，主要位于色素上皮细胞层、神经纤维层。GM6001治疗组MMP2表达与正常对照组有统计学差异（P<0.05），GM6001治疗组与高氧对照组具有显著统计学差异（P<0.01,表1）。二者Pearson相关系数r=0.99830（P<0.05）
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