【摘要】 严重的眼表疾病的治疗一直是眼科临床中的难题,组织工程眼表重建技术为治疗各种可导致失明的眼表疾病开辟了新的途径。理想的组织工程化眼表植片是以可降解材料为支架，在体外进行细胞培养，得到类似于供体的组织工程眼表植片，有效修复各种原因导致的眼表损伤。要构建组织工程化眼表植片，关键在于合适的种子细胞和可供细胞粘附生长的生物支架或细胞外基质。本文将对目前组织工程技术眼表重建在种子细胞来源、载体选择方面的研究进展作简要综述。
【关键词】 组织工程 眼表植片 种子细胞 支架
近年来，组织工程眼表重建技术为治疗各种可导致失明的眼表疾病开辟了新的途径。理想的组织工程化眼表植片是以可降解材料为支架，在体外进行细胞培养，让细胞在材料表面及内部进行三维生长、分化呈多层细胞，最后得到类似于供体角膜或结膜的含有活性细胞的组织工程眼表植片，并且可以有效修复各种原因导致的眼表损伤。要构建组织工程化眼表植片，关键在于合适的种子细胞和可供细胞粘附生长的生物支架或细胞外基质。本文对目前组织工程技术眼表重建在种子细胞来源、载体选择方面的研究作一综述。
1眼表重建的种子细胞
应用组织工程技术制备眼表植片首先要选取合适的细胞来源，通过体外培养扩增的方法获得足够量的种子细胞，再种植于一种生物相容性良好的载体上组成复合眼表植片后移植到患侧眼表。因此无论是角膜上皮的重建还是结膜上皮的重建都必须有合适的种子细胞。
1.1角膜上皮重建的种子细胞
角膜上皮重建的最佳细胞来源是角膜缘干细胞，此外以胚胎干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞以及口腔粘膜上皮细胞等作为种子细胞的动物实验及临床应用已有了报道并取得了突破性的进展。
1.1.1角膜缘干细胞
角膜上皮更新和再生的源泉是角膜缘干细胞(LSCs)，LSCs属于成体干细胞，1986年Schermer等[1]通过实验首次证明了LSCs为位于Vogt栅栏区（Palisandes of Vogt）乳头状结构中的角膜缘基底细胞，并且在培养的兔角膜和角膜缘上皮组织中发现有特异的、分化标志蛋白K3及K12的表达。LSCs具有一般成体干细胞所具有的生物学特性：（1）在活体内循环慢或细胞周期长；（2）细胞小，细胞质处于低分化状态；（3）损伤后或培养时高度的增殖潜能；（4）有自我更新及组织再生的能力[26]。基于干细胞的概念，有学者认为，采用LSCs作为种子细胞在体外进行培养的技术，不仅可以提供足够的干细胞进行移植，而且体外培养的LSCs可能丧失部分抗原性。近年来，自体和同种异体角膜缘干细胞培养和移植的动物实验以及临床应用都有大量的报道。Lindberg等[7]从人眼角膜取下的活组织标本培养后移植到裸鼠的背侧皮下的实验研究表明，LSCs在体外环境中仍保持角膜上皮的特性。Koizumi等[8]以羊膜为载体培养LSCs，为完全缺乏LSCs的11例患者的13眼进行了同种异体LSCs移植。1997年，Pellegrini等[9]首先报道了取健眼角膜缘1～2mm全厚组织片为因严重碱烧伤导致LSCs完全丧失的患者进行自体移植，并成功实现眼表重建。因此，体外角膜缘干细胞培养和移植在很大程度上解决了角膜移植材料不足的问题，而且大大降低了移植排斥反应的发生，以LSCs作为种子细胞联合适宜载体的移植术，是治疗干细胞缺乏的眼表疾病最有吸引力的方法之一。
1.1.2胚胎干细胞
胚胎干细胞(ESC)来源于早期胚胎的多能干细胞，是一种体外培养时能维持正常核型，在一定条件下能诱导分化成各系统细胞的高度未分化细胞。1981年，Evans等[10]延缓着床的胚泡、Martin等[11]用条件培养基分别成功分离、体外培养小鼠ESC。此后，一系列其他动物以及人的ESC相继分离和建系取得成功。大量的研究表明ESC具有以下4个特点：(1)能大量繁殖并保持未分化状态；(2)在一定条件下能向内、中、外3个胚层组织和细胞分化；(3)具有全能性、易于进行基因改造操作；(4)能够形成嵌合体动物从而成为联系细胞和个体之间的桥梁[1,2,1214]。ESC系的确立，为许多组织器官的移植提供了可能，目前，已成功地诱导小鼠等多种动物的ESC向神经细胞、心肌细胞、肺泡上皮细胞、骨细胞、造血细胞、表皮上皮细胞、色素上皮细胞等分化。选取适宜载体（羊膜）利用胚胎干细胞作为种子细胞诱导分化为角膜缘干细胞或角膜上皮细胞已实现了实验性的眼表重建。Homma等[15]将小鼠ESC在覆盖有多种细胞外基质蛋白的陪替氏（Petri）培养皿上进行培养，8d后观察到在Ⅳ型胶原蛋白的培养基上的细胞开始生长并形成上皮样的单层细胞，提示ESC已分化成上皮系的细胞，而免疫组化显示这些细胞表面有K12、CD44即钙粘素的表达，前者特异表达于角膜上皮细胞，后者的表达表示其在角膜修复中起重要作用。然后将培养的细胞移植到角膜损伤的小鼠身上，术后24h内角膜表面发生上皮再形成，形成的角膜上皮也表达移植细胞的标志物，且在以后的追踪期间未发现有畸胎瘤发生。实验结果表明胚胎干细胞在特定条件下经表层角膜基质诱导能够分化为角膜上皮细胞。胚胎干细胞诱导分化有可能为眼表重建和组织工程化角膜的构建提供上皮种子细胞。
1.1.3骨髓间充质干细胞
骨髓间充质干细胞（MSCs）在20世纪70年代中期被发现， MSCs的生物学特性包括：取材方便，容易获得自体MSCs，机体损伤小，易于操作；在体外培养中具有贴壁生长的特性，易于分离纯化；体外培养可以多次传代并保持分化能力，易于扩增数量；具有免疫赦免的特性，可以在异种间或同种异体间进行移植而很少发生移植排斥反应；具有干细胞的多向分化能力，可以分化成骨、软骨、肌肉、肌腱和脂肪等中胚层组织，适用于多种组织的修复重建；更新率低而代谢活力高，容易通过转基因技术获得目标基因并在体内外长期表达[1618]。因此，MSCs可以作为许多组织的组织工程较理想的种子细胞来源。将MSCs作为种子细胞用于眼表疾病的治疗也已有了实验研究。Ma等[19]将在羊膜上生长和扩增的人MSCs移植于化学烧伤导致LSCs缺乏的小鼠眼角膜表面，用裂隙灯每周观察小鼠的角膜，角膜表面逐渐光滑且透明，并能看到角膜下方的虹膜血管。免疫组化显示小鼠角膜表面表达上皮细胞的标志物K3及广泛型角蛋白；说明人MSCs在角膜表面向角膜上皮细胞分化。另外在角膜表面还发现了有CD45、IL2及金属蛋白酶2（MMP2）的表达，提示MSCs移植治疗角膜烧伤的疗效还与移植后炎症和新生血管的抑制有很大关系。因此MSCs可以作为又一种治疗眼表疾病的种子细胞，但是其分化而来的细胞能否发挥正常角膜上皮细胞的功能，能否改善瘢痕的组织结构，尚需更长期的观察及进一步的实验研究。
1.1.4口腔粘膜上皮细胞
近年来，以口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞治疗眼表疾病成为研究的热点。自口腔粘膜分离的上皮细胞与表皮角质化细胞相比处于较低的分化阶段，由于其细胞循环周期相对短暂，体外培养时间也会缩短，且延长培养时间也会维持非角化状态。其次，取活组织后残留的疤痕不明显，口腔也成为获取活组织的一个理想场所。再次，角蛋白K3是角膜分化形态的可靠标志物，最近发现在正常活体口腔粘膜上皮细胞K3表达阳性。以上特征说明口腔粘膜上皮细胞可以作为角膜上皮细胞理想替代物用于眼表重建。
Nakamura等[20]进行了自体（兔兔）和异种（人兔）口腔粘膜上皮细胞培养移植的实验研究，将取自兔和人的口腔粘膜活体组织以羊膜为载体，进行体外培养2～3wk，之后分别移植到眼表损伤的兔模型上。组织学检查发现，经培养的人和兔口腔粘膜上皮细胞层均有5～6层的复层上皮细胞、分化良好，且上皮细胞外观与正常活体角膜上皮细胞相似。免疫组化分析显示角蛋白化相关蛋白K1和K10在粘膜上皮细胞各层皆不表达，角膜特异性K12在各层细胞中亦不表达，而均表达非角化K4、K13和角膜特异性K3，表明以羊膜为载体培养的口腔上皮细胞具有非角化上皮的特征，可以分化为角膜上皮样细胞。而将载有培养细胞的羊膜移植到动物模型的角膜表面，自体组10d即可上皮化，异体组术后尽管加强免疫抑制剂的应用，早期仍发生急性上皮排斥反应，一般2d可上皮化。裂隙灯检查发现愈合上皮清亮、光滑、无荧光素着色。此后Nakamura等[21]报道了人自体口腔粘膜上皮细胞体外培养并移植治疗眼表损伤，术后2d，所有治疗眼的角膜表面光滑、清亮，荧光素染色显示整个角膜表面为培养的口腔粘膜上皮覆盖。术后短期观察，所有患者的术眼结膜炎症很快消退。裂隙灯检查结膜纤维化都得到了很好的抑制，随访中也未发现结膜侵入角膜表面，新生血管仅仅发生在羊膜基质下，且大部分新生血管位于周边角膜而不是角膜中央区域，也未发生任何术后并发症，所有术眼的视力都得到了较大的恢复。因此，采用体外培养口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞来重建眼表，是治疗严重眼表疾病的新途径之一。
1.1.5表皮干细胞
皮肤中存在表皮干细胞，属于成体干细胞之一，在一定条件下具有多向分化能力。Brouard等[22]首先以羊膜为载体体外培养表皮干细胞用于治疗眼表损伤疾病，并取得良好效果。Jin等[23]以去细胞猪角膜基质片作为支架材料，以兔自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞作为种子细胞，在体外构建组织工程角膜，然后移植到碱烧伤的动物模型上。光镜下可见体外培养的组织工程角膜结构与正常角膜相似，具有上皮层和基质层，未见细胞坏死或明显退变，无细胞异常增生。上皮层与基质层结合紧密。上皮层不少于5～6层上皮细胞，排列整齐，无角化。基底层细胞多为矮柱状或立方状，在基底层上方，由不少于4～5层体积较大的细胞组成，呈多边形，略扁平。移植术后1mo，大体观察角膜透明度差，术眼均有结膜轻度充血；术后3mo，大体观察角膜清晰度良好，组织学结构基本恢复正常；细胞印迹学检测杯状细胞消失。术后6mo，外观及组织学结构均恢复正常，无复发及感染出现。免疫组化染色显示，移植后角膜上皮广泛型角蛋白表达阳性。因此，表皮干细胞作为种子细胞用于治疗眼表疾病也有了一定的实验基础。
1.2结膜上皮重建的种子细胞
各种原因引起的双侧结膜上皮严重破坏、结膜功能部分或全部丧失、杯状细胞丧失等改变造成睑球粘连、粘蛋白缺乏、干眼等眼表疾病，极大影响了患者的生活，而结膜重建是恢复眼表正常结构和生理的有效手段。目前自体结膜移植、口腔粘膜移植、羊膜移植已有应用，由于可供移植的自体结膜来源有限，而口腔粘膜非结膜组织，欠理想，羊膜移植成功必须利用周围正常的结膜上皮作为再生上皮的来源，对于严重酸碱烧伤造成的大面积结膜缺损，采用单纯羊膜移植不能达到理想的效果。因此，利用其他细胞来源作为种子细胞诱导分化处结膜上皮，通过组织工程构建生物结膜也就成了最理想的方法之一。Huang等[24]以小鼠ESC作为结膜上皮细胞的来源，采用体外培养的人结膜上皮细胞作为诱导剂，利用双层Transwell非接触共培养系统，诱导小鼠ESC向结膜上皮样细胞分化。培养第3d就有部分ESC分化为上皮样细胞，分化的细胞具有典型上皮细胞形态结构，呈多角型，形态单一，免疫组化显示K13、MUC4阳性，AE5、MUC5AC阴性。有研究表明人类结膜上皮基因表达含量最多的是K13，由于K13在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达，因此K13可能是结膜上皮细胞与角膜上皮细胞鉴别的标志，而MUC4是在结膜上皮细胞表达的粘蛋白，MUC5AC是结膜上皮杯状细胞分泌的胶状粘蛋白，结膜上皮细胞不表达MUC5AC，AE5是在角膜上皮细胞表达的角蛋白[25]。因此说明由胚胎干细胞诱导分化的细胞可能为结膜上皮样细胞，不过还需要对结膜上皮样细胞作进一步鉴定，尤其是分化后的细胞是否确实具有相应的功能，能否应用于眼表重建，还需作进一步的研究。
人皮肤干细胞可作为重建结膜上皮的另一种子细胞。有报道以人结膜去细胞基质为载体，在体外模拟结膜增殖、分化的微环境，从而诱导由多向分化潜能的皮肤干细胞向同一胚层来源的结膜上皮细胞分化。实验结果显示，诱导后的皮肤干细胞可在结膜去细胞基质膜上复层生长并分化为结膜上皮样细胞，表达结膜上皮细胞特异性标记蛋白，呈K8、 K13阳性，同时MUC5AC也呈阳性表达，其中K8在结膜组织中单层的结膜上皮细胞有特异性的表达。由此说明皮肤干细胞也有可能作为种子细胞在体外诱导构建人工结膜用于眼表重建[26]。
2眼表重建的载体
组织工程化眼表植片构建的关键除了种子细胞外，还需要理想的支架来种植种子细胞。并作为载体进行移植。这种材料应是无毒的，可支持细胞生长，促进细胞融合，具有良好的组织相容性，可降解和可塑性，能保持角膜组织特有的透明性、弹性和韧性。目前用于组织工程化眼表植片的支架材料主要分成天然载体和人工合成载体两类。
2.1天然载体材料
2.1.1羊膜
羊膜有人体最厚的基底膜，有利于上皮细胞移行，加强底层上皮细胞的粘附，促进上皮细胞分化，并能阻止上皮细胞凋亡[27]。以羊膜作为载体，则有完整羊膜和去上皮羊膜两种。Grueterich等[28]将体外培养的角膜缘上皮细胞分别种植在完整羊膜和去上皮羊膜上。相差显微镜显示，在完整羊膜和去上皮羊膜上扩增的角膜缘上皮细胞形态小、紧凑且整齐，但后者较前者更整齐。在完整羊膜大部分区域，角膜缘上皮在羊膜上皮细胞最表层扩增，而去上皮羊膜上，所有的角膜缘上皮细胞直接与羊膜基底面接触。免疫组化显示在去上皮羊膜扩增的角膜缘上皮细胞，Cx43、BrdU标记指数都比在完整羊膜的高。进行同种异体移植后，测得在完整羊膜上的复层上皮基底层Cx43、K3为阴性，且有BrdU残留，与体内角膜缘基底上皮的特征相似，与之相反，在去上皮羊膜上Cx43、K3为阳性，没有BrdU残留，与体内的角膜上皮特征相似。实验说明去上皮的羊膜因为暴露了基底膜可能为提高角膜缘上皮细胞的分化潜能提供了更适宜的微环境。国内也有报道联合去上皮羊膜的结膜上皮细胞体外培养，并证明了羊膜基底膜对结膜上皮细胞的正常生长、分化、粘附有良好的引导作用，并为今后实现带结膜上皮细胞的羊膜移植奠定了基础。
2.1.2角膜基质
角膜基质按来源的不同有同种和异种之分，而异种角膜基质由于其具有和角膜最接近的光学性能、韧性，以及来源广泛等优点，成为近年的研究热点。Hori等[29]研究显示，在角膜移植排斥反应中起主要作用的是角膜上皮的郎格罕斯细胞，而去除了上皮和内皮层的角膜植片则不会诱导出受体特异型迟发超敏反应。对异种角膜不同成分的免疫抗原性进行研究显示，角膜基质的免疫抗原性最弱，由此出现了一种生物衍生材料—脱细胞角膜基质。有学者研究发现[30]，经消化酶脱细胞冻干保存的牛角膜基质，可以基本保持角膜基质胶原排列，复水后仍具有一定的透明度，而胶原纤维具有的孔隙，又有利于细胞的粘附生长。另外，用Triton联合2.5g/L 胰蛋白酶、DNARNA 酶，处理3～5h的方法脱细胞处理猪角膜基质制备的组织工程角膜支架材料具有三维网状空间结构，利于细胞及细胞营养物质的扩散，动物实验结果也显示了其良好的生物相容性，可降解性和可塑形性，具有良好的支架作用[31,32]。
2.1.3其他
人晶状体前囊膜含有IV型胶原，可能作为一种支架材料来源用于体外扩增角膜缘干细胞。Alio等[33]利用去除上皮细胞的人晶状体前囊膜为支架进行自体和异体角膜缘干细胞扩增，实验显示了晶状体前囊膜具有良好的生物学特性和生物相容性，并能支持自体和异体的角膜缘干细胞扩增。另外也有研究者将纤维蛋白与琼脂糖复合作为支架材料，尚需进一步的实验研究。除此之外，胶原、壳聚糖亦属于天然载体材料的范畴。
2.2人工合成载体材料
包括聚乳酸（PLA）和聚羟基乙酸（PGA）、纤维蛋白、角膜接触镜。对于这一类支架材料各自的生物学特性、优缺点及其在实验和临床中的应用，已有文献进行综述，故本文不再详细加以阐述。
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