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3培养方法及种植条件
体外培养细胞和在载体上的扩增需要有近似体内的生理环境，培养条件越接近组织生存的自然环境，培养出的上皮就越与正常组织相似。
3.1培养方法
体外培养种子细胞时最重要的一点是能保证培养体系中含有一定数量的种子细胞，并能保持较好地维持其生物学特性。目前可有组织块法和消化法两种培养方法。Kim等[34]分别采用两种方法进行角膜缘干细胞体外培养并对其进行了比较，实验结果显示，与组织块法培养的角膜缘干细胞相比，消化法培养的角膜缘干细胞的细胞活性率更大，细胞克隆生长及向复层上皮细胞分化的速度更快，免疫组化标记的p63、EGFR、Integrinβ、K19等表达阳性的细胞也更多。另外，消化法培养的角膜缘干细胞在电镜下可以看到角膜缘上皮基底膜上有大量细胞胞质突起嵌入的小凹，基底细胞与基质粘附紧密，如采用组织块法培养可能难以保证组织上的干细胞完全迁移到培养体系中。因此，可以认为，在角膜缘干细胞培养中，在干细胞的数量方面，消化法培养要明显优于组织块法培养。
3.2 3T3成纤维细胞、IV型胶原及MMP9
将种子细胞接种到载体上后，要求载体具备能使种子细胞进行扩增的基质微环境。众所周知3T3成纤维细胞作为饲养层细胞在促进种子细胞克隆生长及抑制细胞凋亡方面具有重要作用。IV型胶原是所有基底膜的基本组成结构，Homma等[15]的实验结果提示IV型胶原不仅能够促进干细胞的扩增还能促进ESC分化为具有角膜上皮细胞特性的细胞。另外，最近有研究显示，基质金属蛋白酶9（MMP9）对种子细胞在载体上的扩增有正调节作用，在种子细胞与载体细胞基质的相互作用中，MMP9可能为一关键因素[35]。除此之外，由于眼表在生理环境下是暴露于空气中的，因此还需要有气液交界面促进上皮细胞生长和分化，培养组织工程化眼表植片。
4展望
组织工程技术的兴起和发展为眼表移植和再造提供了最理想的方法，为治疗眼表疾病开辟广阔的前景[36]。工程化眼表移植在实验研究和临床应用上已取得初步成功，尤其是种子细胞和支架材料在组织工程研究中有巨大的应用潜力。尽管还面临许多困难和挑战，但相信随着各项研究工作的不断深入，组织工程化的生物眼表植片最终会取代人供体角膜和结膜，成功而安全有效的应用于临床。
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