【摘要】 目的：探讨P38参与的晶状体上皮细胞凋亡的调节在体外培养的鸡胚胎晶状体半乳糖性白内障中的作用。方法：用30mmol/L半乳糖诱导体外培养的鸡胚胎晶状体建立半乳糖性白内障模型，在培养10d里，通过每日观察、照相、计算晶状体的混浊面积，观察MAPKP38抑制剂SB203580对半乳糖引起的晶状体混浊程度的影响，并用TUNEL原位凋亡细胞染色方法，观察晶状体冰冻组织切片上细胞凋亡情况。结果：半乳糖30mmol/L能诱导体外培养的鸡胚胎晶状体产生周边皮质性混浊，随着半乳糖暴露时间的延长，晶状体的混浊面积增加，P38抑制剂SB203580能有效减轻半乳糖性晶状体的混浊。TUNEL检测显示，在培养2， 5，10d的半乳糖性白内障晶状体切片上，凋亡细胞的百分数分别为1.7%，4.5%和12%，而SB203580处理的晶状体，凋亡细胞数明显减少，在相应点分别是0.7%，1.5%和1.4%。结论：P38可能通过参与晶状体上皮细胞凋亡调控在半乳糖性白内障的形成中起作用。抑制P38激活能阻止晶状体细胞凋亡，减轻白内障形成。
【关键词】 P38 细胞凋亡 半乳糖 晶状体 白内障
白内障是一个多因素引起的晶状体疾病，晶状体上皮细胞是晶状体接受外来刺激抵御外环境中各种损伤的第一道防线，对细胞外的各种刺激因素引起的晶状体上皮细胞内信号转导途径的变化在白内障发生中的作用研究已经受到重视。研究表明多种刺激因素，包括氧化应激[1,2]、渗透压改变[3,4]、紫外线照射[5,6]都能诱导白内障的形成。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK，包括ERK，P38和JNK)是介导多种细胞外刺激的细胞信号转导途径的关键部分，其中P38主要参与高渗透压[7]、高糖[8]、紫外线[9]等介导的信号转导途径。半乳糖引起的高糖、高渗透压刺激使晶状体上皮细胞P38的活性增高[10]，P38的激活引发的细胞内信号转到途径的改变将导致细胞功能的变化。在NMDA诱导的大鼠视网膜神经节细胞死亡中，P38被激活并参与了细胞凋亡前的信号转导通路[11]。
自从1995年Li等[12]报告了晶状体上皮细胞的凋亡参与了人非先天性白内障和多种刺激诱发的体外白内障的形成，人们对各种类型白内障的发生机理的研究有了新的切入点。在糖性白内障的动物模型中，晶状体上皮凋亡数量随白内障的发展而增加，而抗氧化剂能减少凋亡的发生，进而减轻了晶状体混浊的程度[13,14]。根据上述的研究，我们推测半乳糖诱导的晶状体上皮细胞P38的激活有可能参与了细胞凋亡的信号转导，通过抑制凋亡前P38激活可能阻止或减轻糖性白内障的发生。我们利用鸡胚胎晶状体建立了半乳糖性白内障模型，观察了P38的特异性抑制剂SB203580对晶状体混浊程度的影响及其对晶状体中细胞凋亡的影响。结果显示抑制P38的激活能减少晶状体上皮细胞的凋亡，减轻糖性白内障的程度，提示P38参与了半乳糖性白内障晶状体上皮细胞凋亡的信号转导。
1材料和方法
1.1材料
新鲜未孵化法国伊萨婷特种鸡蛋（西安西北农林科技大学养殖场提供），FTXJDF5微电脑全自动孵化器（北京春明方通公司），Stemi SV6型解剖显微镜（Zeiss.Inc，德国），M199培养基（Hyclone Inc美国），胎牛血清（Mcfree Inc.美国），D半乳糖（Amresco Inc美国.），P38抑制剂SB203580（Promega Inc.，美国），TUNEL原位凋亡检测试剂盒（Roche Applied Science.，德国），OCT包埋剂（Sakura Finetek USA.Inc，美国.），DAPI（4’6’diamino2phenylindole, KPL Inc，美国）。
1.2方法
将在4～10℃通风环境下保存的新鲜伊萨婷特种鸡蛋放入微电脑全自动孵化器中，在37.8℃，湿度为55％～60％条件下孵化。取孵化10d的健康鸡胚胎备用。鸡胚胎晶状体的分离和培养方法参照Zhou等[15]的。取出孵化10d的鸡蛋，经表面喷洒酒精后移入超净台。敲开蛋壳，将鸡胚胎完整取出，分离胚胎头部并置于盛有眼用平衡盐溶液的10cm培养皿中，弃去剩余的组织。再将胚胎眼球从头部分离、取出，置于盛有基础培养液（M199+100mL/L胎牛血清）的10cm培养皿中。从眼球的后极部撕开球壁，暴露玻璃体，钳挟住后部玻璃体可将玻璃体及粘连在玻璃体前端的晶状体与虹膜分离。在置于超净台内的解剖显微镜下，从玻璃体上完整摘下晶状体，置于盛有基础培养液的另一培养皿中，在孵箱中孵育8h，剔除混浊不透明的晶状体。将透明晶状体按每孔一枚、前囊膜向上的方向将晶状体水平放置在24孔培养板中，每孔加入0.5mL基础培养液。在基础培养液中加入30mmol/L半乳糖，将晶状体分为对照组和实验组，实验组用P38特异性抑制剂SB203580处理，即在上述培养液中加入10μmol/L SB203580。晶状体在37℃，50mL/L CO2的孵箱中培养10d，隔天换液。
SB203580在每次更换培养液前新鲜配制并随更换培养液而隔日更新。在解剖显微下观察晶状体的混浊程度，并在培养的当天（0），2，4，6，8，10d，在5倍放大倍数下，用连接在显微镜目镜上的数码相机拍摄晶状体照片。用专业图象分析软件Image Pro－Plus 6.0测量晶状体的最大冠状横截面积和混浊部分面积，并计算出晶状体混浊面积占最大横截面积的百分比，以此作为评价混浊程度的参数。
1.2.1免疫荧光染色
选择孵化10d（E10）的晶状体作为正常对照，从各组体外培养2，5，10d的晶状体中分别取3枚标本，在4℃、40g/L多聚甲醛溶液中固定48h后，分别转入50g/L和300g/L蔗糖溶液中进行防冻处理。用OCT包埋晶状体组织，用恒冷冰冻切片机(Leika1850,德国)，沿晶状体矢状轴进行连续切片，切片厚度为6～8μm。从每个标本的切片中选取3张在晶状体中央部的切片做免疫荧光染色。
1.2.2 TUNEL原位凋亡染色
按照TUNEL原位凋亡细胞染色试剂盒的说明处理晶状体冰冻切片，进行凋亡细胞染色。并用1∶14000 DAPI（4’6’diamino2phenylindole）对细胞核进行染色。在荧光显微镜下观察并照相（Leika DMLB2，德国），每个切片分四个区域，即晶状体上皮，2个晶状体赤道区及核区，在40倍镜下计数同一区域的凋亡细胞数和总细胞数，计算凋亡细胞所占的百分比。
统计学处理：用SPSS 1.0统计软件，对各组均数进行Student’s t检验，以P<0.05为有统计学差异。
2结果
2.1鸡胚胎晶状体半乳糖性白内障的观察
在30mmol/L的半乳糖作用下，晶状体的混浊主要出现在两个部位，即中央区前囊下浅层皮质和赤道部周围的皮质。E10鸡胚胎晶状体培养后1d，在前囊膜下的浅层皮质区逐渐出现盘状混浊，并在2d混浊面积达到高峰（图1）。第3天此区域的混浊开始减轻， 4d大部分消退，残留少量很薄的混浊皮质。而在晶状体赤道部出现环状晶状体皮质混浊，并随培养时间的延长逐渐缓慢地向中心部扩展，直到观察结束，这种混浊始终存在。在观察期间没有发现晶状体的核混浊。经测量晶状体的混浊总面积占晶状体的最大冠状横截面积的百分比在培养后2，4，6，8，10d分别为48％，27％，34％，39％和46％（图2）。
2.2 P38抑制剂SB203580对半乳糖性白内障的作用
在晶状体混浊的形态上，实验组与对照组没有明显差异（图1）。在混浊的程度上，SB203580干预后晶状体的混浊面积百分比在0，2d，分别为2％和54％（图2），与对照组没有明显差别。而在4和6d，实验组混浊面积分别为22％和29％，均较对照组明显减小，且有统计学意义（P<0.05）。8，10d的混浊面积均较对照组减少，但无统计学差异（P>0.05）。
2.3半乳糖性白内障晶状体细胞的凋亡
在E10晶状体切片上几乎没有发现凋亡细胞。在培养的晶状体的切片上，赤道部以及核部都可见到散在的凋亡细胞的分布，但在前囊下的晶状体上皮层凋亡细胞增多，呈簇状分布。凋亡细胞经TUNEL染色后细胞核呈固缩的强荧光斑点状（图3）。计算凋亡细胞占总细胞数得百分比（图4），半乳糖性白内障组在2d凋亡细胞数约为1.7％，5d凋亡细胞增加到4.5％，至10d凋亡细胞达12％，各时间点凋亡细胞百分比有显著差异（P<0.05）。提示随着培养天数增加、晶状体混浊程度的增加凋亡细胞数逐渐增多。SB203580干预后，实验组在2，5，10d凋亡细胞百分比分别为0.7％，1.5％，1.4％，均比对照组明显降低（P<0.05）。提示抑制P38的激活能有效抑制半乳糖诱导的晶状体细胞的凋亡。
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