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2 VEGF在眼内新生血管中的表达及作用机制
小鼠靶基因突变技术证实VEGF是血管形成的中心调控者，当VEGF调控紊乱时，就会产生新生血管病。实验研究显示VEGF在多种眼内新生血管性疾病中呈现高表达：谢平等［8］通过检测证实随病程延长糖尿病患者前房液中VEGF浓度增加，并随眼部病情加重而增加，缺氧、VEGF的增加和DR进展是一个正反馈的关系。Philipp等［9］实验发现VEGF及其受体在人的炎症性角膜血管化时有着高表达。孙红等［10］用采用亚激光光凝法建立兔视网膜静脉阻塞(RVO)模型，利用免疫组化法发现其视网膜内核层、血管内皮细胞、周细胞及视网膜新生血管可见较强的VEGF染色，表明VEGF在CRVO视网膜新生血管的发生中具有重要的参与机制。杨秀梅等［11］对激光诱导的大鼠脉络膜新生血管(CNV)模型研究中发现光凝区多种细胞在光凝早期即有表达VEGF，早于CNV形成。
VEGF促进血管生成的确切机制尚未完全清楚，目前只知是多因子、多机制共同参与的复杂过程。多种诱导因素能影响VEGF的表达，包括炎症、高度糖基化终产物（AGEs）、高血糖、氧化应激和致癌基因等，而缺氧是关键性环节，能导致VEGF表达增强3～12倍［1］。
2.1 HIF1对VEGF基因表达的上调作用 Tsuzuki等［12］在低氧诱导的缺血性视网膜病小鼠模型中发现，视网膜低氧诱导因子1α(HIF1α) 的增加与VEGF表达增加一致，且较之为早。HIF1反应基因敲除早产儿视网膜病（ROP）小鼠的视网膜新生血管形成明显减弱。VEGF基因启动子5'端包含有一个含28个碱基对的片段，与低氧诱导因子（HIF1）有高度同源性，在缺氧条件下，HIFlα不能被泛素蛋白酶识别而降解，导致其在细胞中堆积并激活转录，与HIF1β形成二聚体，后者的碱性区域可特异性的与多种缺氧诱导基因启动子缺氧反应元件上5RCGTG3 结合，从而发挥其特异性转录激活活性。目前已证实VEGF是HIF1可诱导表达的靶基因之一。张鹏等［13］应用ELISA法检测了缺氧不同时间培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞对VEGF的表达，结果表明，缺氧可以显著增加RPE细胞对VEGF的表达，在缺氧8h时达到高峰。说明RPE细胞在受到缺氧信号的作用后，HIFlα表达增加，使HIF1α与HIF1β结合形成有转录活性的HIF1在RPE细胞内的聚集增加，其进入细胞核内与基因中低氧反应元件上的HIF1结合位点相结合量增多，从而显著上调VEGF表达。
另外，Lukiw等［14］研究低氧诱导的猴脉络膜视网膜内皮细胞,发现细胞核内的HIF1、核因子κB(NFκB)的DNA结合物及环氧酶2(COX2)RNA于低氧后1h分别增加4.3倍和5倍；VEGF mRNA和蛋白于低氧后增加2～3倍，且明显滞后。小鼠眼内给予环氧酶抑制剂，可显著减少缺氧诱导的视网膜新生血管形成和VEGF mRNA的增加［15］。因此，VEGF的表达可能由双重的、相互依赖的机制来调节，包括HIF1的直接调节和以NFκB为媒介的COX2的表达及前列腺素E2产生的间接调节［16］。
2.2 NO对VEGF表达的介导作用 研究表明，VEGF与其受体结合后通过NO在细胞内进行信号传导而发挥作用。NO是VEGF诱导EC移行和血管发生允许因子，它可以影响VEGF促血管生成和血管渗透性改变的作用。缺氧使组织释放腺苷, 腺苷激活腺苷受体激动剂后促进EC合成VEGF,激活NO合酶（eNOS），eNOS再刺激血管渗透性增加和血管生成。KDR在这个过程中关键性因素，由于它的自磷酸化作用导致eNOS活化。目前众多研究旨在探讨的VEGF促使NO产生的机制。VEGF可能是通过钙调蛋白和磷酸肌醇途径增强NO的生成。VEGF可以活化磷脂酶Cγ（PLCγ），并且能增加DAG和IP3，引起钙离子渗入细胞内，与调钙蛋白结合，从而激活eNOS；PLCγ不仅诱导IP3依赖的钙离子释放，而且通过与DAG结合诱导了钙依赖的蛋白激酶C（PKC）的活性［17］。同样，研究证实NO也能诱导VEGF合成。这些都是有HIF1介导的病理过程刺激而出现的［18］。
NO促进血管形成的机制尚不清楚,可能通过抑制内皮细胞蛋白激酶Cζ(PKCζ)的活性和增加内皮细胞表面整合素(AαBβ) 的活性而促进内皮细胞迁移和增殖实现的。Shizukuda等研究发现VEGF可以抑制人脐静脉内皮细胞系(ECV)的PKCD的特异性活性，而不改变PKCζ的蛋白总量或其mRNA总量，提示VEGF诱导内皮细胞迁移和增殖需要通过NO通路所致PKCD的下降。而ECV细胞中PKCζ的过度表达可以特异性地阻止内皮细胞对VEGF的反应，提示通过NO合成酶的机制抑制PKCζ的活性后才能使VEGF诱导内皮细胞迁移和增殖［19］。Lopez等［20］用PKC抑制剂抑制酪氨酸激酶信号通路后，血清中NO水平也显著下降，进一步说明酪氨酸激酶信号通路是通过影响NO水平而最终产生效应的。Ziche研究表明P物质可以显著增加NOS活性，NOS抑制剂可以抑制P物质所致的内皮细胞增殖和移行。说明NO也参与了P物质致内皮细胞增殖的信号通路。NOS与p53之间存在负反馈通路。NO调节p53的构象使之失活利于炎症组织细胞获得再生能力，包括血管内皮细胞，因此有利于血管生成［3］。
2.3 PEDF对VEGF促血管生成的拮抗作用 目前证实有20多种生长因子能作用于EC，而VEGF和色素上皮衍生因子(PEDF)分别为血管生成刺激因子和抑制因子的代表。年龄、性别、低氧和高糖等都是导致PEDF表达下调的因素。PEDF抑制血管生成的作用非常强大，能对抗多种因子诱导血管生成的作用。它受组织氧含量的调控，直接作用于内皮细胞，诱导内皮细胞凋亡，使血管生成停止［21］。Stellmach等［22］发现PEDF不对已构建的视网膜血管产生明显的损害，即使给予高剂量PEDF，EC正常的形成和发育不受影响。这显示PEDF只对正在进行病理性新生血管组织产生损伤。随着年龄增长，玻璃体中PEDF浓度逐渐降低，缺乏了由VEGF诱导的PEDF基因上调，将有利于眼内新生血管的发展［23］。
现普遍认为缺氧是促使老年性黄斑变性之外的其他新生血管性疾病新生血管产生的主要原因，其诱导眼部新生血管产生的不仅是由于VEGF的增多， 而且也和PEDF的下降密切相关［24］。而PEDF的下降不仅降低了对血管生成的抑制，导致内皮细胞过度增生，还可促进视网膜神经元和RPE细胞退化、变性。Gao等［25］ 通过测量VEGF和PEDF的水平，发现与年龄匹配对照组相比，具有新生血管生成的鼠视网膜VEGF增加5倍而PEDF减少到1/3，导致VEGF/PEDF比例的增大。VEGF/PEDF比例变化的时间过程与视网膜的新生血管形成进展有关，显示血管形成诱导因子和抑制因子之间的失衡，有助于视网膜的新生血管形成。张雷等［26］用半导体激光诱导小鼠CNV模型，现VEGF和PEDF mRNA明显表达于实验性小鼠CNV组织中，两者表达失衡可能在CNV的形成过程中起到调控作用。
2.4 其它因子与VEGF的协同作用
2.4.1 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) bFGF是目前已知的仅次于VEGF的EC有丝分裂原，能刺激细胞的增殖、移行和分化。在体外实验中，bFGF的中和抗体以剂量依赖方式抑制VEGF的促血管生成作用，提示内源性的bFGF参与了VEGF的促血管生成作用，该作用可能是通过磷脂酰肌醇3激酶信号通路来诱导Müller 细胞分泌VEGF的［27］。
2.4.2 转化生长因子β(TGFβ) TGFβ具有调节细胞生长和分化的作用。Nagineni等［28］在人视网膜色素上皮培养中发现，TGFβ能强烈诱导色素上皮分泌VEGF，且TGFβ诱导的VEGF mRNA水平和蛋白分泌能被丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂显著抑制。
2.4.3白介素6（IL6） IL6属于炎前细胞因子，是感染或外伤急性期反应的主要诱导因子。有人提出IL6同样可由低氧所诱导，与VEGF有类似的新生血管因子特征。汤永强等通过检测发现，NVG患者的房水及玻璃体内VEGF和IL6浓度均显著增高，并且IL6可直接诱导VEGF的表达，表明视网膜低氧条件下，局部微环境的改变诱导了VEGF和IL6的产生，而IL6又可促进VEGF的表达增加，两者共同作用导致视网膜、虹膜等的新生血管生成［29］。
2.4.4环氧化酶2（COX2） COX2是前列腺素合成过程中重要的限速酶，其表达可被多种血管内外激活物所诱导。刘宁宁等［30］的研究结果显示在视网膜新生血管形成中VEGF蛋白主要表达在内核层、节细胞层和新生血管上，其表达空间范围与COX2蛋白表达一致，同时COX2与VEGF表达呈显著相关性，提示COX2可能通过诱导VEGF的表达而促进新生血管形成。
2.4.5 细胞间粘附因子1(ICAM1) ICAM1介导细胞间粘接，并互相传递信号，参与调控细胞功能，它是导致视网膜白细胞聚集引起血视网膜屏障破坏(BRB)的重要因素。研究发现，正常人视网膜血管未见ICAM1显著地连续性表达，糖尿病实验大鼠研究显示:视网膜VEGF和ICAM1水平增高，同时伴有视网膜ICAM1和BRB增加；当ICAM1的生物活性被抗体中和时，视网膜白细胞郁积和BRB均被抑制［31］。Moromizato等［32］用损伤角膜缘的方法诱导角膜新生血管（CNV），发现敲除ICAM1基因的小鼠VEGF的表达明显降低，角膜新生血管均较对照组明显减少，从而认为ICAM1参与了VEGF对角膜炎症性新生血管增殖的调控。
2.4.6 胰岛素样生长因子1（IGF1） IGF1通过IGF结合蛋白(IGFBP)的运输，与受体结合产生多种生理效应。在糖尿病视网膜病的研究中发现，IGF1可以上调色素上皮细胞VEGF mRNA的表达和蛋白水平。IGF1的允许作用使VEGF能最大程度地诱导视网膜新生血管的生长，IGF1不足时，尽管有VEGF的存在也不能促血管生长［16］。Slomiany等在REP细胞培养中发现，IGF1可诱导HIF1α蛋白的上调，也可刺激VEGF和IGFBP3的分泌［33］。
2.4.7 雌激素 17β雌二醇不仅作用于性器官，也作用于血管细胞和神经元细胞。Miyamoto等［34］发现， ROP小鼠在高氧时腹腔注射雌二醇，可增加视网膜VEGF mRNA的表达，从而有利于视网膜血管的生长；在随后常氧中给予雌二醇，则减少VEGF mRNA的表达和视网膜新生血管形成。因此，雌二醇可能是不同氧浓度情况下VEGF mRNA水平的重要调节因子。
2.4.8 血管紧张素(ANG)II ANGII可使血管平滑肌收缩，血压升高，是重要的血管活性物质。研究表明，在ROP小鼠新生血管形成期给予血管紧张素转换酶抑制剂，可减少VEGF及VEGFR2mRNA的表达。Sarlos等［35］发现，在SD大鼠ROP模型的视网膜中，ANGII受体mRNA和VEGF及VEGFR2mRNA均增加；而在血管增生期，给予ANGII受体阻滞剂可减少视网膜的血管形成和VEGF及VEGFR mRNA的表达，该作用可能是通过ANGII的1型受体所介导的。因此，ANGII受体阻滞剂可能具有潜在的视网膜保护作用。
3 VEGF与眼内新生血管性疾病的防治
3.1 VEGF及其受体的封闭 抗VEGF蛋白抗体可直接中和VEGF蛋白,抑制VEGF生物效应。Sone等在缺氧诱导的增殖性视网膜病变模型鼠研究中，将VEGF中和抗体在眼内和全身分别注入，结果眼内新生血管都有明显减少［36］。王惕等［37］以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜缺血性病变动物模型，应用不同浓度VEGF受体嵌合蛋白进行玻璃体腔内注射，在组织切片上计数和比较正常和实验条件下以及不同浓度药物注射后视网膜新生血管芽细胞核数。各用药组与高氧对照组间均有显著性差异，说明血管VEGF受体嵌合蛋白能有效抑制视网膜新生血管的增生。［38］
3.2切断信号传导途径 VEGF与受体结合后将产生受体自磷酸化等一系列信号传导，通过阻断传导途径，达到抑制VEGF作用的目的。有报道在鼠模型研究中，应用PTK787，一种受体磷酸化抑制剂，有效阻断了视网膜新生血管化。而在猪的视网膜分支静脉阻塞模型中,通过口服PKC抑制剂LY333531抑制信号传导中的酶蛋白激酶C，有效抑制了视网膜前和视盘上的新生血管［39］。
3.3 抗血管生成的基因治疗 新近发展的反以寡聚核苷酸技术，利用一组特异的核苷酸序列，与VEGF mRNA结合，干扰VEGF mRNA的翻译和VEGF蛋白的生成。这是具有靶特异性，提供抑制基因表达的新技术。曹晖等［40］将反义VEGF质粒用脂质体包裹注入视网膜新生血管模型小鼠眼中， 在一定程度上减少了视网膜新生血管的产生，对EC表达VEGF有抑制作用。蔡春梅等［41］VEGF的短发夹RNA(shRNA)明显抑制乏氧后RPE细胞中VEGF的表达，证明了RNA干扰技术在体外能特异性地抑制培养的人RPE细胞的VEGF表达。进一步证明了RNA干扰技术抑制基因表达有高度特异性。
分子药物的出现为预防新生血管性眼病引起的视力丧失带来前景。对新生血管抑制剂功能位点的确定不仅可以获得抑制能力更强的活性肽，而且可以运用突变技术和基因拼接技术在基因水平对多肽结构定向改造开发出更为有效的基因工程药物。
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