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1．2 方法
1．2．1 聚碳酸酯微孔滤膜的处理 参照文献『7—8]的方法并对其进行了改进．将聚碳酸酯微孔滤膜(直径25 mm，孔径0．8 m)依次浸入5 g／L醋酸20rain(80clC)、蒸馏水漂洗2遍(25 oC)，0．5 g／L明胶溶液孵育60 rain(80~C)；取出，置于6孔培养板内，放人烘箱内3 h(80~C)后，置于超净工作台内，用紫外灯连续照射24 h；收藏备用．
1．2．2 细胞培养及实验分组将EC用DMEM培养基(含丙酮酸钠、2 mmol／L L一谷胺酰胺、150 mL／L的胎牛血清、1×10。U／L青霉素、0．1 g／i．链霉素)在5OmL／L的CO：培养箱(37％)中孵育，按照1：2～1：4的比例传代培养．将EC以1．5 X 10。个／cm 的密度接种于经预处理的微孔滤膜上，待形成致密EC单层后换为实验培养基，以DMEM培养基为基础培养基，添加D．葡萄糖和Ang 1配置成条件培养基，并分成3组进行培养：对照组(DMEM培养基含25 mmo]／L葡萄糖)、高糖组(DMEM培养基含30 mmol／L葡萄糖)、Ang一高糖组(DMEM培养基含30 mmol／L葡萄糖+0．25 mg／L Ang．1)．
1．2．3 致密EC单层形成的判定镜下观察培养板底部未被滤膜覆盖部分长满细胞后，可初步判定滤膜上的细胞亦形成致密单层．为了进一步验证，在预实验中取出接种EC的滤膜，用D—Hanks液漂洗2次，再用20 g／L的甲醛和10 L戊二醛混合液固定1O～20 rain，然后以1．25 g／l,的考马氏亮蓝R250(溶于5：4：1的甲醇：水：冰醋酸混合液)室温下染色40—60rain，蒸馏水漂洗后，置于载玻片上，光镜观察滤膜表面EC生长融合情况．
1．2．4 EC单层通透性模型的建立初步判断EC已经形成致密单层后，弃去原有培养基，换为条件培
养基进行分组培养，培养至不同时间(1，3，5，7 d)，将滤膜取出，用D—Hanks漂洗2遍，装入针头式滤器(有效滤过面积为3．14 em ) J，针式滤器上腔以1 g／L牛血清白蛋白溶液(溶于D．Hanks液)灌注，液体高度为25 em，压力为2．45 kPa．灌注时先平衡5 rain，收集第5～10 rain液体，记录流出液体积，并用考马斯亮蓝法检测下腔收集液的蛋白浓度．
1．2．5 K 及8的测定在该EC单层通透性模型装
置中，由于超滤作用使蛋白质能够通过EC单层，弥散作用极小，故EC单层对蛋白质的渗透压反射系数可按如下公式计算：8=1一C ／C ．其中，C 与c 分别是下腔和上腔液体中白蛋白的浓度．另据Staring的血管内、外液体交换的数学模型，可计算出EC单层的滤过系数：K =J ／(△P一8·△订)．其中，J 是流出液的生成速度(IxL／min·em )，△P是灌注压力，单位是kPa．8是渗透压反射系数，△ 是灌注液和流出液的胶体渗透压差，在测得蛋白浓度的情况下，胶体渗透压按von Hof定律计算：1T(kPa)=2．6·C，其中c为蛋白毫渗量浓度，单位是mOsrn／L，2．6是换算系数，单位是kPa／L·mOsm．
1．2．6 细胞DNA提取及琼脂糖凝胶电泳待培养瓶中细胞融合生长达80％左右，进行分组培养．培养5 d和7 d后，收集细胞于试管内，加入1×SET缓冲液1 mL，10 g／L蛋白酶K 40 IxL，100 g／L的十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)100 IxL，以移液器吹打，使沉淀充分悬浮，55 水浴消化过夜．取500L消化液移入1．5 mL的EP管中，再加入500 L的饱和平衡酚，轻轻摇匀10 rain，以10 000 g离心l5rain后，用剪平的枪头吸取上层水相移于另一空离心管中，再加入等体积提取液(25：24：1的酚：氯仿：异戊醇混合液)，轻轻摇匀10 rain，10 000 g离心15 rain，吸取上层水相于另一离心管中，加入等体积提取液(24：1的氯仿：异戊醇混合液)，轻轻摇匀10 rain，10 000 g离心15 rain，吸取上层水相于另一离心管中，再加入两倍体积预冷(一20℃)的无水乙醇，轻轻摇动离心管至白色絮状沉淀(DNA)析出．10 000 g离心5 rain使DNA沉淀于管底部，弃去乙醇．干燥DNA后，每管加入50 L TE缓冲液，溶解DNA，置～ 20cIC保存．制备8 g／L琼脂糖凝胶，内含0．5 mg／I~溴化乙锭，倒入模具中待其自然凝固后，在电泳槽中倒入0．5×TBE电泳缓冲液．在DNA样品中加入1／6的上样缓冲液， 混合均匀后上样， 5 0 V 电压电泳， 当指示剂移至凝胶的3 ／4 时停止电泳， 取出凝胶， 紫外灯下观察，并记录结果．统计学处理：数据均采用i ± s 表示， 利用S P S S13 ． 0 统计软件进行方差分析及L S D — t 检验， P < 0 ． 0 5认为具有统计学意义．
2 结果
2 ． 1 E C 单层的光镜观察在滤膜上以1 ． 5 X 1 0。／e m。的密度接种E C ，一般经过3 ～ 4 d 后就可以形成致密的E C 单层． 镜下见培养板底部未被滤膜覆盖的部分E C 生长致密， 1 0 0 ％ 融合后( 图1 ) ．
取出滤膜，经固定、染色后， 镜下见滤膜上细胞生长融合亦达10 0 ％ ( 图2 ) ．
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