统计学分析：所得数据用均数士标准差 (±s)表示。采用 SPSS 13.0统计软件包对数据进行正态性检验、方差齐性检验后用单因素方差分析的方法，其均数的两两比较用SNK检验，P<0.05为有显著性意义。
2结果
2.1眼底彩照和FFA检查 空白对照组光凝后7d，光凝区FFA早期即出现荧光素渗漏，晚期渗漏呈圆盘状，此后，随着时间延长，渗漏逐渐增加，至21d时达高峰；光凝后28d，荧光素渗漏面积减少，但与21d相比无统计学意义。中药组光凝后7～14d，光凝区荧光素渗漏逐渐增强至高峰，为65198；至21d时，渗漏面积较14d时缩小，但无统计学意义；至28d时，部分光凝斑形成瘢痕，面积较21d时略增加，但无统计学意义。TA组光凝后7d时，部分光凝区荧光素渗漏，但渗漏面积小，边界清晰；14d时，结合眼底照片看光凝斑呈浓白色瘢痕（图1A），造影上瘢痕着色明显（图1B），不易于区分瘢痕着色上是否伴有轻微的荧光素渗漏，瘢痕面积为96628；此后，瘢痕面积进一步扩大，至28d时达到高峰，为125561。可以看出，7d时，3组之间无统计学差异。14d时，TA组与中药组相比具有统计学意义。21d时，中药组荧光素渗漏面积明显低于空白对照组，具有统计学意义，而TA组瘢痕面积进一步扩大。至28d时，空白对照组和中药组渗漏面积无统计学差异，TA组瘢痕面积达到高峰(表1)。
2.2病理组织学变化 正常BN大鼠HE染色视网膜及脉络膜各层组织结构清晰、完整。空白对照组光凝后7d，光斑处RPE层和Bruch膜明显破坏，外核层破坏或缺损，内核层排列紊乱，视网膜水肿，增生细胞自脉络膜穿过破损的Bruch膜和RPE层向视网膜内层增生，形成早期的CNV，呈纺锤形，其中可见中性粒细胞、巨噬细胞和迁移增生的RPE细胞；光凝后14d，中性粒细胞和巨噬细胞减少，成纤维细胞和胶原纤维增多，RPE细胞迁移增生包绕CNV，CNV厚度进一步增加，与7d时相比，具有统计学意义；此后，CNV厚度变化无统计学意义。中药组光凝后7d，出现类似空白对照组的变化；至14d，CNV厚度达高峰（图2A），为47μm，CNV厚度增加具有统计学意义；至21d时，CNV厚度较14d时明显变薄，具有统计学意义；至28d，CNV厚度较21d时增加，但无统计学意义。TA组光凝后7d时，部分光凝斑出现类似空白对照组的变化，部分光凝斑出现显著的RPE及Bruch膜缺失，未见CNV形成；此后，光凝斑的情况与7d时类似（图2B），7～28d CNV厚度变化无统计学意义。可以看出，7d时，CNV厚度3组之间无统计学差异；光凝后14d，TA组CNV厚度明显低于空白对照组和中药组，有统计学差异；光凝后21d，空白对照组CNV厚度高于中药组和TA组，具有统计学意义；至28d，3组之间CNV厚度无统计学差异（表2）。
2.3 CNV中Ⅷ因子相关抗原表达 正常视网膜内核层微血管及神经纤维层大血管、脉络膜毛细血管内皮细胞可见Ⅷ因子抗原染色呈红色，其他部位无阳性表达。空白对照组光凝后7d，光凝区视网膜下间隙散在阳性染色细胞，光凝后14d，光凝区视网膜下阳性染色细胞显著增加,达到高峰（图3A），此后，阳性细胞染色较前减少。中药组光凝后7d时Ⅷ因子阳性染色细胞最多，此后，阳性染色逐渐减少（图3B），至28d时最少，A为32。TA组光凝后7d时，Ⅷ因子阳性染色为338；至14d时，增加至622；此后，阳性细胞染色较前减少。7d时，中药组Ⅷ因子染色高于空白对照组和TA组，但3组之间统计学无差异；14d时，空白对照组Ⅷ因子染色高于中药组和TA组，但3组之间无统计学差异；21d和28d时，3组间Ⅷ因子染色A值无统计学差异（表3）。
2.4脉络膜血管铺片观察 激光共焦扫描显微镜下见空白对照组光凝后7d在光凝斑边缘及光凝斑中心的深部脉络膜血管可见FITC显影，此后，CNV逐渐增多，光凝后28d见光凝斑深部CNV明显来源于深部脉络膜血管，朝向视网膜神经层生长，CNV与周围的脉络膜比较呈网状高荧光斑。中药组CNV面积较小，在21d时表现出较明显的抑制作用（图4A），28d时部分CNV已经形成瘢痕，但仍计入面积。曲安奈德组7d时即表现出明显的CNV抑制作用，至21d时大部分激光光斑处已形成瘢痕（图4B），至28d时瘢痕面积扩大。因标本少，而且，部分标本背景荧光明显，测算不准确，未行统计分析（表4）。
3讨论
近年来，随着对CNV 生成机制的逐渐认识，人们对CNV的治疗也从激光光凝、光动力疗法(PDT)、经瞳孔温热疗法(TTT)、手术切除新生血管膜或黄斑转位、以及放射疗法等转向新生血管抑制剂治疗，如地塞米松[4]、曲安奈德[5],Bevacizumab[6],ranibizumab[7],infliximab[8],FLK1单抗[9]及中药姜黄素[10，11]、三七、丹参[12,13]等已成为治疗新生血管性疾病的研究热点。我们在实验中观察到，空白对照组7～21d，CNV逐渐增大、增厚，一直处于活动期，与既往实验结果一致[14]，28d时CNV表现出下降的趋势，考虑与光凝20点后诱发更为强烈的损伤反应，使随后的愈合反应加速进行有关。与对照组相比，TA组在早期起始阶段（7，14d）即明显抑制CNV形成，表现为CNV厚度、Ⅷ因子抗原阳性反应物吸光度和脉络膜血管铺片面积均较对照组小；这种抑制作用持续至后期（21，28d），表现为CNV厚度、Ⅷ因子抗原阳性反应物吸光度持续下降。这一结果与既往实验结果一致[15]，可能与TA抑制RTPK,Ca2+通路后引起血管内皮生长因子（VEGF）和碱性上皮生长因子(bFGF)下调，内皮抑素上调，抑制脉络膜视网膜内皮细胞迁移、增殖，促进脉络膜视网膜内皮细胞自G2M期向S期转化等有关，具体的作用机制至今尚不完全清楚[16]。同时，我们还观察到尽管TA组CNV抑制作用明显，但28d时光凝后所形成的瘢痕十分明显，表现为FFA瘢痕着染面积和脉络膜血管铺片面积明显大于对照组。关于TA治疗实验性CNV后，光凝斑形成面积的大小既往未见报道，本实验中出现光凝后瘢痕明显的情况可能与光凝斑数目较多有关，也可能是TA治疗后的真实反映，尚需进一步实验证实。我们还发现，与对照组相比，凉血化瘀中药组在7d时未表现出明显的CNV抑制作用，在14d时开始表现出抑制作用，在21d时达到作用高峰，至28d时部分CNV形成瘢痕，提示，在早期CNV，促血管生成分子大量增加，凉血化瘀中药对促血管生成分子作用不明显，故未表现出早期对CNV的抑制作用；随后，中药促进了血管生成抑制分子的大量分泌，进而导致了对CNV明显的抑制作用。当然，这些分析尚需要进一步的实验依据来证实。实验中还观察到，中药组可以缩短实验性CNV病程，同时，形成的瘢痕较小。王晓庆等[10]观察到凉血化瘀中药中的药物姜黄的主要成分姜黄素可抑制VEGF，bFGF诱导的鸡胚绒（毛）膜尿囊（CAM）小血管生成，对内皮细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。Thaloor[11]发现，姜黄素对基质金属蛋白酶有抑制作用。李景恒等[12,13]观察到，中药三七和丹参能通过减少血管增生性视网膜病变小鼠的VEGF及细胞间粘附分子1（ICAM1）的含量来阻止视网膜新生血管形成。这些研究可能在一定程度上说明了本实验凉血化瘀中药抑制CNV的物质基础。但是，高冬等[17]观察到，常用的活血化瘀中药赤芍、当归、红花、川芎、丹参及黄芪有促进CAM新生血管生成的作用。可见，中药药理作用错综复杂，而中药复方的作用及机制就更加复杂难辨，其具体的作用机制尚需要进一步的实验证实。
上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
