【摘要】 目的：评价凉血化瘀中药及曲安奈德对氪激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization CNV）中基质金属蛋白酶MMP9和基质金属蛋白酶抑制剂TIMP2表达的影响。方法：659nm激光诱导BN大鼠CNV模型，随机分成空白对照组（每日生理盐水灌胃）、中药组（每日中药灌胃）和曲安奈德组(激光后1d玻璃体腔注射曲安奈德5μL，0.2mg）各16只。分别在光凝后7，14，21，28d随机选取4只大鼠处死，摘除眼球，行病理切片及免疫组织化学检测MMP9及TIMP2蛋白在CNV组织中的表达。结果：空白对照组在光凝后7d MMP9达到高峰，此后逐渐下降；中药组在光凝后14d达到高峰，但峰值低于空白对照组，此后逐渐下降；曲安奈德组在光凝后7d达到高峰，峰值介于空白对照组和中药组之间，此后逐渐下降，在14～21d出现平台期。空白对照组在光凝后14d TIMP2达到高峰，此后逐渐下降；中药组在光凝后14d达到高峰，峰值高于空白对照组，此后逐渐下降；曲安奈德组在光凝后14d达到高峰，峰值介于空白对照组和中药组之间，此后下降。结论：在下调MMP9、上调TIMP2的表达进而抑制CNV形成方面，凉血化瘀中药的作用强于曲安奈德。
【关键词】 凉血化瘀中药 脉络膜新生血管 曲安奈德 MMP 9 TIMP 2
0引言
脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是导致年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性脉络膜视网膜病变和高度近视等多种眼底疾病视力丧失的主要原因。探讨CNV的发病机制与有效治疗是目前国内外学者的研究热点。凉血化瘀中药对年龄相关性黄斑变性和中心性渗出性脉络膜视网膜病变的CNV均有良好的治疗效果[1,2]，我们应用免疫组化方法观察分别给予凉血化瘀中药灌胃和曲安奈德(triamcinolone acetonide, TA)玻璃体腔注射治疗后大鼠CNV组织中MMP9及TIMP2表达，以期部分了解中药抑制CNV的机制。
1材料和方法
1.1材料 清洁级BN大鼠48只，9～11周龄，体质量200～250g，雄性（北京维通利华实验动物有限公司提供）。实验前双眼前节和眼底检查均正常。凉血化瘀中药[1]由中国中医科学院眼科医院中药房负责煎制。TA 40g/L（昆明积大制药有限公司）；兔抗MMP9多克隆抗体（Santa Cruz公司），羊抗TIMP2多克隆抗体（Santa Cruz公司），SP试剂盒及AEC显色试剂盒（福州迈新公司）。
1.2方法 实验前100g/L水合氯醛溶液3.5mL/kg行大鼠ip，双眼散瞳，用659nm氪激光（功率360mW，直径50μm，曝光时间0.05s）环绕视盘光凝2排（20个光斑），以光凝后有气泡产生或伴有轻度出血（有时伴有轻响）标志击破Bruch膜，记为有效点。按随机数字表将大鼠分为空白对照组、中药组和TA组3组，每组16只。空白对照组自动物模型制作后1d开始给予生理盐水1.5mL灌胃，2次/d；中药组给予凉血化瘀的中药1.25g/kg灌胃，2次/d；TA组在动物模型制作后1d给予TA 5μL（0.2mg）玻璃体腔内注射。分别于光凝后7，14，21，28d随机选取4只大鼠处死，摘除眼球，立即置于40g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定24h，经梯度乙醇脱水后石蜡包埋，平行于角膜至视盘的矢状位连续4μm切片切至激光斑处，常规HE染色。MMP9及TIMP2相关抗原免疫组织化学检测按试剂盒说明书进行，采用SP法染色，AEC显色，经苏木素复染后封片。羊抗人MMP9多克隆抗体的工作浓度为1∶100，兔抗人TIMP2多克隆抗体的工作浓度为1∶500，高压热修复1min，着色部位为红色。通过ImagePro Plus 6.0图像分析系统半定量测定MMP9及TIMP2在CNV组织的表达，所得数据用均数±标准差 (±s)表示。
统计学分析：采用 SPSS 13.0统计软件包对数据进行正态性检验、方差齐性检验后用单因素方差分析的方法，其均数的两两比较用SNK检验，P<0.05为有显著性意义。
2结果
2.1 MMP9在CNV中的表达 空白对照组光凝后7d，在CNV组织上可见MMP9在色素上皮样细胞表达，同时散在于CNV的基质中（图1A），光凝后14d，MMP9在色素上皮样细胞及成纤维细胞中表达，有的MMP9染色包绕呈管腔状（图1D），此后，MMP9表达逐渐减弱，至28d，MMP 9在少量成纤维细胞表达。凉血化瘀中药组MMP9表达与空白对照组类似，但7d吸光度（A）较低（图1B），14d时MMP9表达达到高峰,此后表达减弱。TA组7d（图1C），14d时MMP9表达与空白对照组类似，但A较低，21d时MMP9的表达强于空白对照组和中药组，出现一平台期（表1）。
2.2 TIMP2在CNV中的表达 空白对照组光凝后7d在CNV组织上可见TIMP2散在表达于CNV基质中（图2A），14d TIMP2在成纤维细胞中表达，有的TIMP2染色包绕呈管腔状（图2B），至21～28d TIMP2表达明显减弱。凉血化瘀中药组TIMP2表达与空白对照组类似，但7d（图2C），14d TIMP2表达明显强于空白对照组，至21，28d，未见TIMP2的明显表达。TA组7，14d时部分激光斑TIMP2表达与空白对照组类似，部分激光斑处形成无定形胶冻样瘢痕组织，瘢痕组织可着染TIMP2（图2D）,TIMP2表达介于空白对照组和中药组之间，至21，28d，未见TIMP2的明显表达（表1）。
表1 BN大鼠光凝后视网膜MMP9和TIMP2阳性反应物吸光度（略）
aP<0.05 vs7d；cP<0.05 vs 14d；eP<0.05 vs 21d；gP<0.05 vs对照组；iP<0.05 vs对照组和中药组,kP<0.05 vs 中药组
3讨论
CNV的形成是基底膜降解，内皮细胞增殖、迁移和毛细血管管腔形成的多步骤过程，其形成受到促血管生成因子和血管生成抑制因子的严格调控，还受到血管内皮细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)交互作用的影响。目前已证实，损伤Bruch膜、扰乱视网膜色素上皮(RPE)细胞的 ECM、或扰乱内源性抑制剂，是CNV生成的条件[3]。Bruch膜及其周围基质的变化、以及基质金属蛋白酶(MMP)的活化是CNV发生的早期重要步骤[4]。MMP9为明胶酶，是分泌型MMP的一种，可以降解体内血管壁基质中的Ⅳ型和Ⅴ型胶原。研究发现，MMP9主要表达于膜边缘的RPE样细胞，位于RPE细胞下增厚的Bruch膜样基质及血管结构中，并且认为，PDT抑制CNV形成的机制与抑制MMP9的活性有关[5,6]。但动物实验结果并不统一，Kvanta等[7]认为，MMP9 mRNA在激光光凝前的大鼠眼中低表达，激光光凝后表达也不升高。而张士胜等[8]观察到，MMP9 mRNA在用半导体二极管激光器(810nm)诱导的C57BL／6J小鼠CNV模型中的早期明显增加，增长趋势于激光后1wk停止，后期则保持在较稳定水平。我们发现，空白对照组MMP9在光凝后7d达到高峰，主要位于色素上皮样细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞周围基质上，此后表达逐渐下降，提示MMP9的活化在CNV发生早期起重要作用，可以促进CNV的形成。凉血化瘀中药作用后7d时MMP9的表达较空白对照组显著下降，提示在CNV发生早期，中药可以通过抑制MMP9来抑制CNV形成；14d时与空白对照组比较，MMP9表达略低，但统计学无差异，提示中药不能持续抑制MMP9的表达，其持续抑制CNV的作用尚与其他因子有关。TA作用后，7～14d时MMP9表达持续低于空白对照组，提示TA可以通过持续抑制MMP9的表达来抑制CNV形成和发展[9]；7d时MMP9表达介于空白对照组和中药组之间，提示TA对MMP9的抑制作用弱于中药组；21d时MMP9的表达显著高于空白对照组和中药组，出现一平台期，可能与激素抑制炎性反应的同时，也抑制了机体自身的免疫应答反应，使本应下降的MMP9出现了持续表达，同时也提示TA对晚期CNV的抑制作用与其他因子有关[23]。
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