【摘要】  目的 对豚鼠非遮盖眼和形觉剥夺性近视(form- deprivation myopia，FDM)眼玻璃体腔注射重组人胰岛素样生长因子2(recombinant human insulin-like growth factor，rhIGF-2)，观察rhIGF-2对两组豚鼠眼屈光度、眼轴长度及视网膜－脉络膜内源性IGF-2 表达水平的影响，探讨rhIGF-2对豚鼠眼球发育的调控作用以及该调控作用与形觉剥夺的关系。方法 选取3周龄的三色豚鼠80只，随机均分为2组。A组为非遮盖组，分为A1～A5组，每组8只：A1组为空白对照组；A2组为阴性对照组，单眼玻璃体腔注射20 ?滋l牛血清白蛋白；A3～A5组为rhIGF-2注射组，注射量分别为1 ng、10 ng、100 ng（20 ?滋l）。B组为单眼遮盖组，分为B1～B5组，各组遮盖眼处理同A1～A5组。实验第14天测量遮盖眼屈光度和眼轴长度，检测视网膜－脉络膜IGF-2 的表达水平。结果 非遮盖组中，rhIGF-2注射组(A3、A4、A5组)的屈光度、眼轴长度与对照组(A1、A2组)之间差异无统计学意义(P>0.05)； 但A4、A5组的IGF-2 水平明显低于对照组(P=0.000)，A3组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；A3、A4、A5组内源性IGF-2表达水平与rhIGF-2注射量呈负相关(r=-0.940，P=0.000)。单眼遮盖组中，B4、B5组与对照组(B1、B2组)相比，近视屈光度增加，眼轴延长，内源性IGF-2表达水平下降(P=0.000)，而B3组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)；B3、B4、B5组的屈光度及内源性IGF-2 表达水平与rhIGF-2注射量呈负相关(r=-0.832，-0.858，P=0.000)，眼轴长度与rhIGF-2注射量呈正相关(r=0.863，P=0.000)。结论 rhIGF-2玻璃体腔注射对豚鼠非遮盖眼的屈光度和眼轴长度无影响，但可使形觉剥夺眼近视屈光度增加，眼轴延长，其效应呈浓度依赖性。rhIGF-2可下调豚鼠眼视网膜－脉络膜内源性IGF-2的表达，效应呈浓度依赖性。提示rhIGF-2在形觉剥夺存在的条件下可促进形觉剥夺性近视的发展。

   【关键词】  胰岛素生长因子；近视；形觉剥夺

Effect of recombinant human IGF-2 on the development of the eyeball in form- deprivation myopia in the guinea pig

    DENG Zhihong*， TAN Jia， LIU Shuangzhen， et al.

    * Eye Center， Tianjin Medical University， Tianjin China，300070

    ［Abstract］  Objective  To clarify the effects of recombinant human insulin-like growth factor (rhIGF-2) on the development of guinea pig eyes and the relationship between its function and form- deprivation (FD). Methods  Eighty 3-week-old guinea pigs were included in the study. They were randomly divided into 2 groups： group A (n=40) was the non-FD group. Group A was further divided into 5 subgroups： group A1 (n=8) was the control group， group A2 (n=8) was the negative control group that received an intravitreous injection of 20 μl bovine serum albumin (BSA)； groups A3~A5 (n=24) received intravitreous injections of 1 ng， 10 ng and 100 ng（20 μl） rhIGF-2. Group B (n=40) was the FDM group. Group B was further divided into subgroups B1~B5 using the same criteria as group A. The refraction and axial length of all guinea pigs were measured at day 7 and the expression of IGF-2 was assayed by Western-blot. Results  In the non-FD group， the rhIGF-2 injection did not have significant effects on either refraction or axial length (F＝0.217， 0.562； P＝0.928， 0.692)， while there was a significant difference in the level of IGF-2 expression in groups A3~A5 (P＝0.000) and there was a negative correlation between the level of IGF-2 expression and the concentration gradient of rhIGF-2 (r=-0.940， P=0.000). In the FDM group， the degree of myopia and axial length increased in group B4 and group B5 compared to that of groups B1 and B2. The degree of myopia and the level of IGF-2 mRNA of groups B3~B5 had a negative correlation with the concentration gradient of rhIGF-2 (r=-0.832， -0.858， P=0.000)， while axial length had a positive correlation (r=0.863， P=0.000). Conclusion  The intravitreous injection of rhIGF-2 has no effect on the degree of myopia and axial length of the non-FD guinea pig， while it can induce significant increases in the degree of myopia and axial length in the FDM guinea pig and the effects are concentration dependent. The rhIGF-2 can greatly promote the development of FDM under FD conditions.

    ［Key words］  recombinant human IGF-2； myopia； form-deprivation

在近视眼发病机制的研究中，胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，IGF-2）日益受到研究者的关注。体外研究[1]表明，IGF-2参与了实验性近视眼后极部的巩膜重塑过程。本研究通过对豚鼠非遮盖眼和形觉剥夺性近视眼玻璃体腔注射重组人IGF-2（recombinant human IGF-2，rhIGF-2），旨在探讨并证实rhIGF-2对豚鼠眼球发育的影响以及该调控作用与形觉剥夺之间的关系。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  选取3周龄的三色豚鼠80只，随机分为2组。A组（40只）为非遮盖组，按不同处理分为A1～A5组，每组8只：A1组为空白对照组，未注药；A2组为阴性对照组，单眼玻璃体腔注射20 ?滋l牛血清白蛋白（bovin serum albumin，BSA）；A3～A5组为rhIGF-2注射组，单眼玻璃体腔注射 rhIGF-2，注射量分别为1 ng、10 ng、100 ng（20 ?滋l）。B组（40只）为单眼遮盖组，按不同处理分为B1～B5组，每组8只，各组遮盖眼处理与A1～A5相同。

    1.2  实验处理

    1.2.1  近视模型的制作及处理  取3周龄豚鼠，右眼以半透明薄壁塑料眼罩遮盖造成形觉剥夺。分笼饲养，室内日光灯照明，每天光照与黑暗周期为12 h/12 h。将rhIGF-2(购自SIGAMA公司，美国)溶于1 g/L的BSA载体中，试验眼玻璃体腔每次注射20 ?滋l，分别于实验第1、第8天各注射一次，于实验第14天处死豚鼠。

    1.2.2  屈光度及眼轴测量  实验第14天时，由同一验光师采用视网膜镜检查法测量双眼屈光度，测量3次后取平均值作为最终结果；以氯胺酮＋氯丙嗪麻醉后行A型超声测量眼轴，测量3次后取平均值作为最终结果。

    1.2.3  标本采集  处死受试豚鼠，快速摘除眼球，立即在显微镜下取视网膜－脉络膜组织，置于液氮中保存备用。

    1.2.4  Western-blot检测  视网膜-脉络膜蛋白样品的制备及蛋白定量：取豚鼠视网膜－脉络膜组织，加入全细胞裂解液200 μl，冰上以匀浆器匀浆，4℃高速离心（12000 r/min）10 min，取上清液备用，用分光光度计测定蛋白浓度。

    十二酰基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2和Western Blotting：按常规方法制备120 g/L分离胶和40 g/L浓缩胶。每份样本加入变性液，煮沸5 min，上样每孔内确保加样品的蛋白总量相等，同时加入Marker，电泳完毕后转移至硝酸纤维素膜，用含 5%脱脂奶粉的液封闭硝酸纤维素膜1 h；然后加入1∶1 000兔抗鼠IGF-2抗体(购自SANTA CRUZ公司，美国)，室温振荡1 h，加入1∶2 000辣根酶标记IgG和Mark抗体，室温振荡1 h，清洗后，将 PVDF膜放入强化学发光试剂中1 min，轻轻摇动，保鲜膜包裹后，经X光片曝光，显影定影，显示特异的蛋白信号。用全自动图像分析系统对免疫印迹信号进行分析。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 11.5统计软件对各组组内差异进行方差分析，对rhIGF-2注射剂量与屈光度、眼轴长度以及IGF-2表达水平进行相关分析等统计学处理。

    2  结果

    2.1  rhIGF-2注射对非遮盖眼屈光度和眼轴长度的影响  非遮盖眼rhIGF-2注射组（A3、A4和A5组）与空白对照组（A1组）和阴性对照组（A2组）屈光度均维持在轻度远视状态，各组之间差异无统计学意义（F＝0.217，P＝0.928）(见表1)。

    2.2  rhIGF-2注射对非遮盖眼视网膜－脉络膜IGF-2 表达水平的影响  非遮盖眼rhIGF-2注射组的A4、A5组视网膜－脉络膜IGF-2 表达水平明显低于对照组（A1、A2组）（P＝0.005，0.000；0.000，0.000），但A3与A1、A2组之间差异无统计学意义（P=0.877，0.603，0.406）。相关分析显示：A3、A4、A5组中rhIGF-2的注射剂量与IGF-2表达水平呈负相关(r=-0.940，P=0.000)，即在1～100 ng范围内，随着rhIGF-2注射剂量的增大，非遮盖眼IGF-2 mRNA表达水平下调(见表1、图1)。

    2.3  rhIGF-2注射对形觉剥夺眼屈光度和眼轴长度的影响  注射rhIGF-2的形觉剥夺眼中，B4和B5组与单纯形觉剥夺眼（B1、B2组）相比，其近视屈光度明显增加，眼轴延长(P=0.000)，但B3组与B1组、B2组之间差异无统计学意义（P=0.966，0.865）；相关分析显示：B3、B4、B5组中rhIGF-2的注射剂量与屈光度呈负相关（r=-0.832，P=0.000），与眼轴长度呈正相关（r=0.863，P=0.000），即随着rhIGF-2注射剂量的加大，形觉剥夺眼的近视屈光度增高，眼轴增长(见表2)。

    2.4  rhIGF-2注射对形觉剥夺眼视网膜－脉络膜IGF-2表达水平的影响  注射rhIGF-2的形觉剥夺眼中，B4、B5组的视网膜－脉络膜IGF-2 表达水平明显低于对照组（B1、B2组）（P＝0.000），但B3与B1、B2组之间差异无统计学意义（P=0.509，0.542， 0.649）；相关分析显示：B3、B4、B5组中rhIGF-2的注射剂量与IGF-2表达水平呈负相关(r=-0.858，P=0.000)，即在1～100 ng范围内，随rhIGF-2注射剂量的增大，形觉剥夺眼视网膜－脉络膜IGF-2 表达水平明显下调（见表2、图2）。

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