【摘要】  目的 检测与单核/巨噬细胞株THP-1细胞共培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞c-fos的表达。方法 在Transwell小室中共培养THP-1细胞和人RPE细胞达不同的时间（0，2 h，3 h，24 h，48 h，72 h），采用免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达变化。结果 在未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中，c-fos表达微弱或不表达，细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光。与THP-1细胞共培养达2 h时，RPE细胞的荧光强度逐渐增强并出现核移位。随着与THP-1细胞共培养时间的延长，RPE细胞c-fos mRNA的表达（0 h，0.40±0.07）开始逐渐增强，于2 h时达峰值(2 h， 0.91±0.10，P=0.002)，随后表达减弱，至3 h时(3 h，0.51±0.08)降至近未共培养时的水平。结论 与THP-1细胞共培养可在短期内迅速上调体外培养的人RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达，且蛋白表达出现核移位现象，提示THP-1细胞可引起RPE细胞c-fos的活化。

    【关键词】  视网膜色素上皮；THP-1细胞；c-fos

Up-regulation of c-fos in cultured human retinal pigment epithelial cells by co-culturing with THP-1 cells

    WANG Jingbo*， HUI Yannian， GUAN Juan*， et al.

    * Department of Ophthalmology， the Second Affiliated Hospital， General Hospital of Chinese People’s Liberation Army， Beijing China， 100091

    ［Abstract］  Objective  To study the effects of co-culturing with THP-1 on the expression of c-fos in human retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro. Methods  RPE cells were co-cultured with THP-1 cells in transwell inserts for 0， 2， 3， 24， 48 and 72 h. Immunofluorescence staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the levels of c-fos protein and mRNA in RPE cells. Results  RPE cells that were not co-cultured with THP-1 cells revealed either faint or no green fluorescence of c-fos in the cytoplasm and some nuclei. When co-cultured with THP-1 cells for 2 h， green fluorescence labeling of c-fos showed an obvious increase with stronger green fluorescence translocated to the nuclei. After co-culturing with THP-1 cells， c-fos mRNA （0 h， 0.40±0.07） increased rapidly in RPE cells and the enhancement peaked at 2 h (2 h， 0.91±0.10， P=0.002)， and declined to a similar level as the cells that were not co-cultured after 3 h (3 h， 0.51±0.08). Conclusion  Co-culturing with THP-1 cells can quickly up-regulate c-fos protein and mRNA in cultured human RPE cells within a short time period， and induces its nuclear transposition， which suggests the THP-1 cells can activate c-fos.

    ［Key words］  retinal pigment epithelium； THP-1 cell； c-fos

    视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE）细胞是参与葡萄膜炎、增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）等[1]多种眼病的重要细胞[1-3]。其中单核/巨噬细胞的浸润参与了这些眼病的发生和发展，并对RPE细胞的早期基因改变及其后的生物学性状变化起关键作用。c-fos为一重要的核转录因子，属于即刻早期反应基因家族[4]，是与多数细胞增殖有关的原癌基因。本实验中，我们欲研究与单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）共培养的体外培养的人RPE细胞的c-fos表达，从而明确c-fos在RPE细胞早期生物学性状改变中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料  Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium， DMEM）购自美国Hyclone公司，新生小牛血清购自杭州四季青公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，Taq酶购自美国MBI公司，兔抗人c-fos多克隆抗体购自武汉博士德公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗兔IgG购自北京中杉公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。c-fos引物由上海生工合成。3个不同个体成年健康男性角膜移植后的眼球用于行原代RPE细胞培养，取第4～第8代细胞用于实验。THP-1细胞购自美国标准生物品收藏中心。

    1.2  方法  c-fos引物，上游5′ TGCTGAAGGAGAAGGAAAAA 3′，下游5′ TGCATAGAAGGACCCAGATA 3′ [344碱基对（bp）]；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物，上游5′ GAAGTGAAGGTCGGAGTCA 3′，下游5′ TTCACACCCATGACGAACAT 3′（402 bp）。

    RPE细胞消化后，接种于6孔培养板中，置于5% CO2孵箱中培养。当细胞融合>75%时，将Transwell小室置于培养孔上，并将THP-1细胞接种于小室上方，分别共培养达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。细胞共培养结束后，拿去Transwell小室，弃去培养液，换以37℃预热的磷酸盐缓冲液（PBS）并轻柔晃动培养板2次，然后收集细胞，以备行RNA提取。同时设对照组，即为RPE细胞更换37℃预热的、含10％新生牛血清的新鲜DMEM，培养时间分别达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。

    RPE细胞在共培养结束后，以台盼蓝染色计数法检测各处理组的活细胞数目。具体步骤如下：收集各孔细胞，制备成单细胞悬液，并与等体积的0.3%的台盼蓝溶液混合，在光学显微镜下计数并计算细胞存活率。

    细胞爬片用95％乙醇固定20 min，PBS漂洗；用3％过氧化氢灭活15 min，PBS漂洗；用羊血清室温封闭20 min；加入0.5% 曲拉通X-100，室温置10 min；置兔抗人c-fos多克隆抗体（1∶100），湿盒4℃过夜，PBS漂洗；用FITC标记羊抗兔IgG（1∶100），湿盒37℃孵育60 min，PBS漂洗；用甘油缓冲液封片，激光共聚焦显微镜观察并在同一电压条件下照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照。

    收集的细胞用Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA第1链，产物进行PCR。退火温度分别为：c-fos，54℃，1 min；GAPDH，55℃，1 min。GAPDH反应为30个循环，c-fos为35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值，以c-fos的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-fos mRNA的水平。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 13.0统计分析软件，对刺激因素作用后不同时间点间的比较进行单因素方差分析。绘图采用Origin 7.0软件。

    2  结果

    2.1  细胞活力检测结果  台盼蓝染色实验测得，RPE细胞与THP-1细胞共培养后，细胞的存活率在96%以上。

    2.2  免疫荧光染色结果  在尚未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中，c-fos表达微弱或不表达，细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光（见图 1）。随着与THP-1细胞的共培养时间的延长，RPE细胞c-fos的表达逐渐增强，荧光强度增高，呈绿色或深绿色。THP-1细胞共培养达2 h时，与未行共培养的RPE细胞比较，c-fos的表达明显增强，并出现核移位，细胞核呈强绿色荧光（见图 2）。在与THP-1细胞共培养后，RPE细胞c-fos蛋白表达的荧光强度于2 h时达峰值，随后荧光强度开始减弱，并逐渐降至未行共培养时的荧光强度水平。对照组各时间点RPE细胞c-fos的表达无明显改变。

    2.3  THP-1细胞共培养上调RPE细胞c-fos mRNA的表达  与尚未共培养的RPE细胞相比，与THP-1细胞共培养达2 h时，RPE细胞c-fos mRNA的表达即显著增强（F=52.37，P=0.002），随后表达开始减弱，于3 h时降至与未共培养时的相近水平，随后基本维持在该水平（见表1、图3）。对照组内各时间点c-fos mRNA的表达变化无统计学意义（F=0.75，P=0.64）。

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