【摘要】 目的 研究不同切削厚度的准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis，LASIK）后兔眼基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的表达，以探讨LASIK手术的不同切削深度对角膜的胶原结构的影响。方法 选取成年新西兰白兔28只(56眼)。随机分成A（正常对照组）、B、C、D四个组，每组14眼。B、C、D组行LASIK手术，使残留的基质床厚度分别为整体角膜厚度的70%、50%、30%。术后第6个月，用ELISA法检测各组角膜明胶酶（MMP-2和MMP-9）的含量，用RT-PCR法检测TIMP-2的mRNA的表达量。结果 术后第6个月，各组均有MMP-2和MMP-9的表达，MMP-2表达量差异无统计学意义（F=0.456，P>0.05），MMP-9表达量的差异亦无统计学意义（F=1.676，P>0.05）。各组均有TIMP-2 mRNA的表达，差异无统计学意义（F=0.003，P>0.05）。结论 兔眼正常角膜有MMP-2、MMP-9及TIMP-2的表达。LASIK术后第6个月，各组角膜细胞MMP-2、MMP-9及TIMP-2的表达量与正常角膜无差异，这说明LASIK术后第6个月时角膜胶原结构已基本稳定。如有继发性圆锥角膜的发生，并非是由于手术本身引起的主要胶原降解增多所导致，可能与遗传易感性及生物力学相关，其具体作用机制有待进一步研究。
【关键词】 角膜磨镶术，激光原位/方法；角膜；胶原；基质金属蛋白酶；动物，实验
Expression of MMP and TIMP in cornea cells after LASIK with different residual stroma bed in rabbits
HE Rui， ZHOU Yingxia， FENG Yi， et al.
Shanxi Eye Hospital， Taiyuan China， 030002
［Abstract］ Objective To study the influence of different residual cornea bed of laser in situ keratomileusis (LASIK) on the collagenic construction of cornea through investigating the expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in cornea cells for different residual stroma bed after LASIK for six months. Methods Twenty-eight New Zealand white rabbits (56 eyes) were divided into four groups at random. Fourteen eyes were controled as group A. Rabbits in groups B， C and D were performed LASIK with residual stroma bed of the cornea 70%， 50% and 30% respectively. Six months after operation， aquired the cornea tissue to perform indirect enzyme-linked immuno-absordent assay (ELISA) for the quantity of Gelatinase， zymography for the activities of Gelatinase， reverse transcription-polymerase chain reaction (PT-PCR) for the expression of tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2) mRNA. The changes of cornea structures were observed by transmission electron microscope. Results ?譹?訛Indirect enzyme-linked immuno-absordent assay (ELISA) proved that MMP-2 and MMP-9 were expressed in cornea cells in groups of A， B， C， D after LASIK for six months， and MMP-2 has no significant difference between the four groups （F=0.456， P>0.05）， MMP-9 has no significant difference too （F=1.676， P>0.05）. ?譺?訛Reverse transcription-polymerase chain reaction (PT-PCR) showed that the TIMP-2 mRNA was expressed in cornea cells in groups of A， B， C， D after LASIK for six months， and there was no significant difference between the four groups （F=0.003， P>0.05）. The expression of the TIMP-2 mRNA was increase with the artherectomy intensity. Conclusion MMP-2， MMP-9 and TIMP-2 are expressed in normal cornea cell of rabbit， and there are no significant difference between the four groups after LASIK for six months. If has the keratoconus occurrence because surgery itself causes the collagen degeneration to increase by no means causes， possibly it is related to the heredity susceptivity and biological mechanics， affects the mechanism pending further to study specifically.
准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis，LASIK)是目前世界上最为重要的屈光矫治术式之一。近年来，LASIK术后继发性圆锥角膜的病例屡有报道[1-4]，这种严重的并发症会对术后视力造成破坏性的影响[5]，且在某些病例中会延迟发生，是对公众健康问题的潜在忧患[6]。目前对于引起该并发症的影响因素尚无明确的结论。本研究从动物实验方面研究了不同切削厚度的准分子激光原位角膜磨镶术后兔眼基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs)的表达，探讨该并发症的发生原因。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 选取成年新西兰白兔28只，随机分为A(正常对照组)、B、C、D四组，每组各7只（其中每组随机取一只做透射电镜检查）。每只实验动物双眼为实验眼。
1.2 术前检查 术前行裂隙灯及检眼镜检查，排除眼前、后节病变；用气流眼压计测量眼内压，超声测量中央角膜厚度。
1.3 手术方法 术前2 d以0.3%妥布霉素眼液(美国Alcon公司产品)滴眼，术前全身麻醉，并用0.4%盐酸奥布卡因眼液(日本参天公司产品)表面麻醉动物。各组处理方法如下。
①A组：不行手术。②B组：用KM5000D(无锡市康明医疗器械有限公司)微型角膜板层刀制备一完整的角膜瓣，将瓣掀起，瓣下基质面以193 nm的准分子激光切削，使残留的基质床厚度为整体角膜厚度的70%。切削区直径为6.0～8.0 mm(修边区宽度为2 mm)，层间用BBS（沈阳兴齐制药厂产品) 冲洗干净，将瓣复位，条纹试验(-)，术毕滴0.3%妥布霉素眼液2或3滴。③C组：手术方法同B组，但剩余瓣下角膜厚度为整体角膜厚度的50%。④D组：手术方法同B组，但剩余瓣下角膜厚度为整体角膜厚度的30%。
1.4 术后处理及随访观察 术后1周以0.3%妥布霉素眼液(美国Alcon公司产品)滴眼。术后第6个月随访观察，分别行以下各项检查：①用裂隙灯观察角膜上皮和角膜瓣的愈合情况、层间情况。②测量眼内压。③用超声测量中央角膜厚度。术后第6个月，过量麻醉致死动物，立即取出眼球，制作角膜标本。
1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)分析 将于-83℃保存的兔角膜组织匀浆，取上清制备标本品，具体操作如下。
1.5.1 实验步骤 ①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100 μl，第1孔加标准品 100 μl，混匀后用加样器吸出100 μl，移至第2孔，如此反复对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔吸出 100 μl弃去，使之体积均为100 μl。第8 孔为空白对照。②加样：待测品孔中每孔各加入样品稀释液100 μl，标本品100 μl。③将反应板充分混匀后置37℃温箱，90 min。④倾去液体，用洗涤液洗4～5 次，拍干。⑤每孔中加入第一抗工作液 100 μl，将反应板充分混匀后置于37℃温箱，60 min。⑥倾去液体，用洗涤液洗4～5次，拍干。⑦每孔中加入酶标抗体工作液100 μl，混匀后置于37℃温箱，30 min。⑧倾去液体，用洗涤液洗4～5次，拍干。⑨每孔中加入底物工作液100 μl，置于37℃暗处5～10 min。⑩每孔加终止液100 μl，立即在酶标仪波长450 nm处测OD 值。
1.5.2 结果测定 ①各测定孔OD值减去空白对照孔（0 ng/ml）OD 值，为测试实际 OD 值。②MMP-2及MMP-9测定以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0 ng/ml的OD值在半对数纸上做图，以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，画出标准曲线。③根据每个测定样品的实际OD值在该曲线图上查得各自含量（μg/ml）。
1.6 逆转录聚合酶链反应（PT-PCR）分析
1.6.1 引物设计及合成 引物根据Gene Bank兔GAPDH(做内参照)应用primer 5.0程序设计，并由上海生物科技工程有限公司合成。TIMP-2引物：上游为5′-CCAAAGCGGTCAGCGAGAA-3′，下游为5′-ACCCAGTCCATCCAGAGGC-3′，扩增片段为394 bp；内参β-acting引物：上游为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，扩增片段为270 bp。
1.6.2 RT-PCR法检测 ①Trizol一步法抽提总RNA：取冰冻角膜一只放入匀浆器中匀浆，加入Trizol试剂0.8 ml，匀浆；加氯仿200 μl，震荡后离心，取上清；加入等体积异丙醇混匀，离心，弃上清；加75%酒精1 ml，离心后弃上清，空气中风干；加入无核酶水，于58℃中孵育10 min，得到的RNA溶于焦炭酸二乙脂(diethylenepyroearbonate，DEPC)中，用紫外分光光度计检测RNA纯度。②逆转录(25 ?滋l反应体系)：取2 ?滋g RNA，加入1 μg OligodT及无核酶水，共12 μl，70℃反应5 min，冰浴5 min。加入M-MLV5xBuffer 5 μl，dNTP 5 μl，200 U/μl M-MLv逆转录酶1 μl，40 U/μl Rnsin 0.7 μl及dd H2O至25 μl，42℃孵育90 min。③PCR(25 μl反应体系)：取cDNA 1 ?滋l加入引物上、下游各25 pmol，2.5 mmol/L Dntp 2.0 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl。PCR Buffer(10 mmol/L His-HCl，pH值为8.3，50 mmol/L KCl) 2.5 μl，Taq多聚酶0.5 μl。扩增条件分别为：β-actin变性94℃ 30 s，复性56℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，共33个循环。TIMP-2变性94℃ 30 s，复性53℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，共35个循环。取10 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色，在紫外光下观察，并用计算机凝胶成像系统提取图像，通过比较TIMP-2与β-actin的密度值进行半定量分析。
1.7 统计学方法 本组数据经SPSS 13.0统计学软件处理，总体比较采用One-way ANOVA，多重均数间比较采用LSD法，两两比较采用t检验。
2 结果
2.1 术后随访观察情况 ①裂隙灯观察：手术B、C、D组各眼角膜瓣复位良好，角膜清，无混浊。②眼内压：术前眼压(6±1.28)mmHg，术后眼压(4±2.18)mmHg，无继发性青光眼。③中央角膜厚度：术前测量实验动物的中央角膜厚度均值为(388 ±24)μm，各组差异无统计学意义（P>0.05）。术后实际中央角膜厚度与术前预计角膜厚度较为接近，见表1。
2.2 ELISA法定量检测各组MMP-2和MMP-9的含量 各组均有MMP-2和MMP-9的表达，MMP-2表达各组差异无统计学意义（F=0.456，P>0.05），MMP-9表达各组差异无统计学意义（F=0.315，P>0.05），见表2。
2.3 RT-PCR法检测各组TIMP-2 mRNA的表达
术后第6个月，各组均有TIMP-2 mRNA的表达，各组差异无统计学意义（F=0.003，P>0.05），具体见图1、2、3及表2。随着切削深度的增加，各组TIMP-2 mRNA的表达量没有差异。
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