【摘要】  目的 通过检测瘦素在增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)和增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreous retinopathy，PVR)中的表达，探讨瘦素在PDR、PVR发生、发展过程中可能的调节机制。方法 分别用免疫组织化学染色的方法和酶联免疫吸附实验检测30例PDR患者、20例PVR病变患者眼内视网膜前膜中瘦素的表达，以及患者的血清、眼前房水、玻璃体液中瘦素的浓度。用Chi－Square Tests统计学方法分析和比较PDR、PVR与对照组之间瘦素表达的差异。结果 免疫组织化学染色结果：30例PDR患者中，有18例患者眼内视网膜前膜的瘦素受体呈阳性表达，阳性率为60%，与对照组比较，差异有统计学意义；20例PVR患者中，有3例患者眼内视网膜前膜的瘦素受体呈阳性表达，其中2例为血管纤维性视网膜前膜，1例为细胞纤维性视网膜前膜，阳性率为15%，与对照组比较，差异无统计学意义。ELISA结果：检测30例PDR患者的血清、眼前房水、玻璃体液中瘦素的浓度，与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05）；检测20例PVR患者的血清、眼前房水、玻璃体液中瘦素的浓度，与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 瘦素可能主要是通过促进新生血管的生成参与到增殖性糖尿病性视网膜病变的发生、发展中，与增殖性玻璃体视网膜病变的发生、发展无明显相关性。

   【关键词】  瘦素；增殖性糖尿病性视网膜病变；增殖性玻璃体视网膜病变

 The correlate study of leptin in the patients with proliferative diabetic retinopathy and proliferative vitreous retinopathy

    MA Tao， LI Wenhua.

    Shanxi Eye Hospital， Taiyuan China， 030002

    ［Abstract］  Objective  To study the expression of leptin in proliferative diabetic retinopathy （PDR） and proliferative vitreous retinopathy （PVR） and the correlation of leptin with the occurrence and development of PDR and PVR. Methods  Immunohistochemistric technique was used to detect the expression of leptin in epiretinal membrane of PDR (phase Ⅴ，Ⅵ， 30 cases) and PVR (20 cases). ELISA was used to detect the concentration of leptin in the patient’s serum， ocular aqueous humor and vitreous humor. All data were compared and analyzed by SPSS 13.0. Results  Immunohistochemistrically， the expression of leptin in epiretinal membrane of PDR (Ⅴ， Ⅵ phase) was positive in 18 cases out of 30 cases (the positive rate was 60%). The expression of leptin in epiretinal membrane of PVR was positive in 3 cases out of 20 cases (the positive rate was 15%). The concentration of leptin was significantly higher in the serum， ocular aqueous humor and vitreous humor of the patients with PDR than the control group (P<0.05). There was no significant difference of the concentration of leptin in serum， aqueous humor and vitreous humor between the patients with PVR and the control group (P>0.05). Conclusion  Leptin may play an important role in the occurrence and development of PDR， but has no significantly correlation to the development of PVR.

    ［Key words］  leptin； proliferative diabetic retinopathy； proliferative vitreous retinopathy

    增殖性糖尿病性视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是糖尿病最常见的并发症之一，目前已成为世界范围内的主要致盲眼病，引起人们越来越多的关注[1]。目前PDR的发病机制至今尚未完全明了，缺血、低氧是其中的因素之一，另外多种细胞生长因子在PDR的发生、发展中起到的作用已经被大家所认识。其中瘦素（leptin）是最近发现的、可在眼内表达从而影响PDR发生、发展过程的一种细胞因子，其作用机制可能是通过引起内皮细胞的损害，刺激新生血管形成而发挥作用。增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreous retinopathy，PVR）可由多种原因造成，其增殖性反应可以表现在视网膜前膜、视网膜下膜以及视网膜本身。目前大多数研究者认为，PVR的发病机制是细胞介导的病理过程，一些细胞及其生成的生物活性因子与基质的相互作用，使细胞生长的生长因子与抑制因子失去平衡，如血管内皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子，从而导致细胞的增生和膜的形成。瘦素是目前发现较有争议的、可能参与打破这种平衡的细胞因子之一。本研究旨在探讨瘦素在增殖性糖尿病性视网膜病变和增殖性玻璃体视网膜病变中的表达，以及与它们之间的相关关系，为临床治疗提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  PDR患者  30例我院PDR患者，年龄40~69岁，平均55岁；糖尿病病程5~22年，平均12年。平均体重指数（27.01±1.60）kg/m2，PDR病变分期为Ⅴ、Ⅵ期。手术均采用玻璃体切除术，术前留取血清样本，术中取眼前房水、玻璃体液，剥离视网膜前增殖膜。

    1.1.2  PVR患者  20例我院PVR患者，年龄22~45岁，平均34岁。平均体重指数为（23.17±1.80）kg/m2。包括原发性视网膜脱离后发生PVR的患者9例、多次视网膜脱离复位术后PVR 4例、外伤后导致PVR 5例、继发于视网膜血管炎、视网膜静脉阻塞性疾病引起的牵引性视网膜脱离以及PVR的患者2例等。PVR分期为C3~D3。所有患者手术方式选为玻璃体切除术，术前留取血清样本，术中取眼前房水、玻璃体液，剥离视网膜前增殖膜。

    1.1.3  对照组  免疫组化对照组，取健康人群角膜移植供体眼的视网膜共10例，排除全身病变及眼疾，处理方法同上。ELISA检测对照组：血清、眼前房水样本取自普通的孔源性视网膜脱离的患者（没有增殖性视网膜病变、糖尿病以及全身性疾病），PVR分期在B级以下，无玻璃体、视网膜增殖表现，样本量各为30例；玻璃体液对照取自健康人群角膜移植术后的供体眼（病例与视网膜正常对照组相同），样本量为10例，各个处理方法同上。

    1.2  实验方法

    1.2.1  免疫组织化学染色  切片行常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水冲洗，滴3% H2O2于湿盒内，于室温置20 min封闭内源性酶，蒸馏水冲洗。进行酶消化：予0.1%胰酶消化5~10 min，蒸馏水冲洗，滴加5% BSA封闭液，于室温置20 min，甩去多余液体，滴加适当稀释的一抗（1∶150的兔抗人瘦素受体抗体）于湿盒内，于4℃冰箱内过夜。用PBS冲洗后，滴加生物素化二抗（兔IgG）于37℃孵箱中孵育20 min。用PBS洗3次，滴加试剂SABC液，于37℃孵箱中孵育30 min，用PBS洗3次后显色。DAB显色，1.5 ml蒸馏水加ABC显色试剂各一滴，混匀后加到盖玻片上，在显微镜下观察，适时用蒸馏水充分冲洗，终止显色反应，行苏木素染色、脱水、透明和中性树脂封片。

    1.2.2  瘦素受体表达的观察与评价  在显微镜下观察DAB显色，背景清晰，阳性为细胞浆内出现棕黄色颗粒，阳性对照片由武汉博士得生物制剂有限公司提供。

    1.2.3  ELISA  取出-80℃保存的待测血清、眼前房水、玻璃体液标本，自然解冻。取出与待测样品相应量的板孔标记。洗板：300 ?滋l/孔1×清洗液，甩去，在干净的吸水纸上拍干，洗3遍；加检测抗体：100 ?滋l/孔，37℃ 1.5 h，洗板同上，洗4遍；加酶复合物：100 ?滋l/孔，37℃ 30 min，洗板同上，洗5遍；显色：显色液A 50 ?滋l/孔，显色液B 50 ?滋l/孔（先加A液再加B液，100 ?滋l/孔），37℃ 20 min；终止：终止液100 ?滋l/孔，按显色液加样顺序加样；测定450 nm的OD值（用OD540或OD570校正），减去空白孔。用OD值对已知浓度的标准品做图，测定样品浓度。

    1.2.4  ELISA结果的评价  分别比较PDR、PVR患者的血清、眼前房水、玻璃体内瘦素浓度与对照组的差异。其中因瘦素是由脂肪组织产生，故机体脂肪量的多少是影响瘦素水平的最重要的因素，体重指数是反映机体脂肪组织多少的参数，用体重指数校正可以去除机体脂肪对瘦素水平影响而导致的误差，使结果更具客观性。

    1.3  统计学方法  所有统计学分析均使用SPSS 13.0统计软件来完成，采用Chi－Square Tests方法和组间t检验。

    2  结果

    2.1  HE染色  ①PDR患者的视网膜前膜为血管纤维性视网膜前膜，镜下可见增生的纤维组织、散在少量细胞成分及多量的新生血管（见图1）。②PVR患者的视网膜前膜以细胞纤维性视网膜前膜多见。HE镜下观察：18例为细胞纤维性视网膜前膜，可见增生的纤维组织、成纤维细胞、色素上皮细胞、炎性细胞、巨噬细胞等；2例为血管纤维性视网膜前膜：镜下可见增生的纤维组织和新生血管形成，以及少量的成纤维细胞、色素上皮细胞、炎性细胞、巨噬细胞等（见图2）。

    2.2  免疫组织化学染色  ①PDR患者的视网膜前膜免疫组织化学染色镜下观察：18例视网膜前膜的各类细胞中以成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞为主的细胞浆内可见棕黄色颗粒分布明显，12例视网膜前膜的免疫组化染色未见到阳性细胞，阳性率为60%（见图３）。对照组正常视网膜组织的各层细胞浆中未见棕黄色染色颗粒，无瘦素受体的阳性表达，结果为阴性（见图４）；PDR实验组与对照组之间的差异有非常显著的统计学意义（P<0.01，见表1）。②PVR患者的视网膜前膜免疫组织化学染色镜下观察：17例 PVR患者的视网膜前膜的各类细胞的胞浆内未见到棕黄色颗粒分布，为阴性结果（见图５）；2例继发于视网膜血管炎、视网膜静脉阻塞后的PVR患者视网膜前膜的细胞浆中以及1例细胞纤维性视网膜前膜的细胞浆内有棕黄色颗粒分布，为阳性结果，阳性率为15%，阳性细胞主要为成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞（见图６）。对照组正常视网膜组织的各层细胞浆中未见棕黄色染色颗粒，无瘦素受体的阳性表达，结果为阴性（见图４）；PVR实验组与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05，见表2）。

    2.3  ELISA法检测瘦素浓度

    2.3.1  眼内各个部位瘦素浓度的比较  PDR患者的血清、眼前房水、玻璃体液瘦素的平均浓度见表3，平均体重指数为(27.01±1.60)kg/m2；对照组血清、眼前房水、玻璃体液瘦素的浓度见表3，平均体重指数为(24.54±1.32) kg/m2。两组眼内各个部位的数值经过体重指数校正后差异有统计学意义（P<0.05），统计结果见表3、表4。

    2.3.2  PVR患者的血清、眼前房水、玻璃体液瘦素的平均浓度见表5，体重指数平均值为(23.17±1.80)kg/m2；对照组血清、眼前房水、玻璃体液瘦素浓度见表5，平均体重指数为(24.54±1.32 )kg/m2。两组眼内各个部位的数值经过体重指数校正后差异无统计学意义（P>0.05），统计结果见表5、表6。

[1] [2] 下一页